[发明专利]甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法。

背景技术

甜高粱是普通高粱的一个变种，生长耗水量仅为玉米的1/3，亩产可高达5～10吨，其茎秆汁液是发酵制造酒精和培养酵母的理想生物质原料。用甜高粱取代玉米等粮食作物作为原料生产酒精的新工艺，不仅能节约粮食、降低成本，有力地带动发酵产业、振兴酒精生产行业、而且能推进可再生能源事业和畜牧业的发展。发展甜高粱产业关键在于甜高粱新品种的选育与高效栽培。传统育种技术在甜高粱的产量、品质、抗病、抗虫等特性改良方面已发挥了重要作用，但在生产上对品种、品质要求日益提高的情况下，因受现有资源的限制，单靠传统的育种方法难以取得重大突破。利用转基因技术改良高粱品种已引起广泛的关注。植物转基因技术通常依赖于植物快捷、高频率再生体系的建立。然而，甜高粱同普通高粱一样，通过组织培养获得再生植株相对比较困难。目前针对甜高粱组织培养的研究还很少。

从甜高粱的成熟胚和未成熟胚诱导愈伤到获得整个再生植株以前虽已有过一些报道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep.5：349-351；Ma et al.，1987，Theor App Genet.73：389-394；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci.58：692-693)，但遗憾的是能够从外植体诱导胚性愈伤到再生出植株的仅限于个别几个品种(Smith and Bhaskaran，1986，Springer-Verlag，New York，pp.220-223；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep.15：72-75)。近年来随着人们对甜高粱应用价值的重视，甜高粱组织培养方面的研究也取得了快速的发展。通过对不同基因型品种及外植体、不同培养基成分(包括蔗糖浓度和激素配比等)、不同培养条件对愈伤的诱导、增殖及分化再生能力的影响进行系统研究，为甜高粱品种建立有效的组织培养再生体系提供了参考(Zhao et al.，2008，Chinese Bull Bot.25：465-468；Zhao et al.，2010，African Journal of Biotechnology.9(16)：2367-2374)。但以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚为外植体，目前为止以幼穗为外植体的研究尚很少见有报道。

近年来各国科学家正在致力于相关方面的研究，相比其它作物，甜高粱组织培养植株再生困难，而且受基因型的限制，因此甜高粱遗传转化研究进展缓慢，目前尚很少见成功报道。据报道，2009年美国昆士兰大学的研究人员培育出了世界上首例木质素含量降低的转基因甜高粱植株，他们将编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)的DNA片段导入甜高粱品种中，通过改变木质素的含量和组分获得了成功，该项研究成果已申请了专利(Pub.No.US 2010/0058496A1)。其它研究尚未见相关报道。

因此建立甜高粱的遗传转化体系，通过转基因技术培育甜高粱新品种，使其更好地满足实际生产的需求。转化体系的研发将为绿色能源生物燃料和生物材料的开发利用开辟新的途径。

发明内容：

本发明的目的是提供一种以甜高粱幼穗材料的组织培养形成再生体系，为以甜高粱幼穗诱导的愈伤组织的组织培养再生体系及遗传转化方法提供基础研究。

甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法，包括如下步骤：1)选取幼穗，旗叶期长约2-5cm幼穗，切成薄片，2)将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT(玉米素)2.0mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂pH 5.8，3)将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，所述继代培养基为：诱导培养基+KT(激动素)0.2mg/L，4)再将其接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS基础培养基+ZT2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8，5)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH5.8，6)转移至小培养钵中炼苗培养，7)移栽至温室或大田。

优选2-3cm幼穗，薄片约3mm长。