[发明专利]镰刀菌BYB2及其在微生物发酵制备阿拉伯胶酶中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株新的阿拉伯胶酶产生菌株——镰刀菌(Fusarium sp.)BYB2，及其在微生物发酵制备L-阿拉伯糖中的应用。

(二)背景技术

L-阿拉伯糖属于五碳醛糖，多以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖体及类似于高等植物半纤维的形式存在。L-阿拉伯糖是一种低热量的甜味剂，也是重要的药物中间体，并且可用于生化领域中细菌培养基的制备以及香料合成等，应用范围相当广。但是由于L-阿拉伯糖现有的生产工艺复杂，生产成本高，导致价格居高不下，阻碍了其在食品或医药等领域的应用。

目前，L-阿拉伯糖的制备方法有化学合成法和酸解法。化学合成法步骤多，工艺复杂，原材料昂贵。酸解法对反应设备的要求较高，同时产生的混合糖成分复杂，后续分离纯化工艺的难度较大。日本三和兴产株式会社已于2003年在中国申请了“通过酸水解生产L-阿拉伯糖的方法”的专利，在一定程度上限制了我国采用该技术生产L-阿拉伯糖的产业化应用。L-阿拉伯糖还可以采用酶解法，就是以阿拉伯胶为原料，采用微生物产生的水解酶进行水解，其具有选择性强，后序处理相对简单，反应条件温和等优点，更关键的是它可以避开日本传统酸解法制备的专利保护，是我国生产L-阿拉伯糖的工业化应用的一条途径。

已见文献报道的酶法制备L-阿拉伯糖都以废弃农产品为原料，往往存在L-阿拉伯糖的产率低、分离纯化困难等问题。阿拉伯胶是一种来源广泛的树胶，其L-阿拉伯糖的含量高达30％以上，是自然界中L-阿拉伯糖含量最高的物质，如以阿拉伯胶为原料，酶解阿拉伯胶生产L-阿拉伯糖的效率将明显提高。酶法水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖有着底物专一性强、产物得率高、反应条件温和等优点，适用于高纯度L-阿拉伯糖的大量制备。目前在国内外还未见有关采用酶解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖的报道。采用酶解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖的技术关键就是获得活力高、性能稳定的阿拉伯胶酶，而微生物是获得阿拉伯胶酶的主要来源，适合酶的大规模工业化生产。因此，筛选产酶活力高、生长繁殖快、营养要求低的微生物菌株发酵产酶，并用阿拉伯胶酶来水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖具有重要的理论意义和应用价值。

(三)发明内容

本发明提供一株阿拉伯胶酶产生菌株——镰刀菌(Fusarium sp.)BYB2，及其在制备L-阿拉伯糖中的应用，较好地克服了L-阿拉伯糖现有的生产工艺复杂，纯度低、生产成本高等缺点。

本发明采用的技术方案是：

一株阿拉伯胶酶产生菌——镰刀菌(Fusarium sp.)BYB2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2010087，保藏日期：2010年4月19日。

所述镰刀菌BYB2的菌落特征如下：涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速，30℃培养3～5d，长出粉质、粉白色、浅粉色至肉色、略带有紫色、高为3～5mm的菌落，且菌落在形成初期呈突起絮状，菌丝白色质密。所述镰刀菌BYB2的孢子特征如下：小型分生孢子为单胞、卵形、着生方式为单生、产孢细胞为简单瓶梗，且常在瓶梗顶端聚成球团；大型分生孢子为镰刀形、少许弯曲、分隔数多为3分隔。

本发明所述镰刀菌BYB2由浙江省杭州市下城区浙江工业大学校园金合欢(Acacia farnesiana)树下土壤中分离和筛选得到野生菌株，再经紫外线照射诱变处理获得。

野生菌株的分离方法为：在采集的土壤中加入阿拉伯胶进行微生物富集培养，使得土壤中能以阿拉伯胶为唯一碳源生长的微生物数量增加，再将富集培养物稀释后涂布于以阿拉伯胶为唯一碳源的平板培养基上，30℃培养至菌落数量不再增加，挑取平板上生长较大的菌落接种于斜面培养基上，30℃培养3d，将进一步摇瓶复筛。

用接种环分别挑取初筛的各个菌株新鲜斜面孢子2环，接入液体产酶培养基中，30℃、200r/min振荡条件下发酵培养3d。将发酵液用滤纸过滤去除菌丝体后，取清液测酶活力，筛选出产酶活力最高的菌株。

所述的平板培养基和斜面培养基组成相同，终浓度组成为：阿拉伯胶25g/L，NaNO₃ 3g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6。