[发明专利]一种牙本质磷蛋白的生化检测方法及装置

说明书

技术领域

本发明属于电化学酶联免疫测试技术领域。特别涉及牙根吸收早期诊断的一种牙本质磷蛋白的生化检测方法及装置。

背景技术

大多数患者在正畸过程中都会出现轻度牙根吸收，矫治结束后不会出现牙齿松动。但是少数患者会出现严重的牙根吸收，牙齿会出现松动甚至脱落；正畸牙根吸收是正畸治疗的主要并发症。如果能够及早诊断出牙根吸收，可以防止患者牙齿松动加重或脱落。目前主要使用曲面断层、根尖片、CT等影像学方法诊断牙根吸收，迫切需要寻找一种更为敏感、安全、及时的新方法实现对牙根吸收的早期诊断、早期预防。无创性生化方法是近年来牙根吸收诊断方法的新方向。主要的实验依据是牙根吸收患者口腔龈沟液中牙本质磷蛋白抗原的量会增加，通过酶联免疫检测法(ELISA)测定其中牙本质磷蛋白(DPP)含量变化可间接诊断牙根吸收。与传统的影像学方法相比，ELISA法具有敏感性高、辐射损伤性小、可以实现实时监控等优点，在牙根吸收的临床诊断中具有良好的应用前景。目前主要使用的分光光度酶联免疫法检测牙本质磷蛋白含量变化，该方法原理简单，仪器价格便宜，可以目测得到结果，并且仪器的自动化程度高，是一种成熟的检测手段。但是，由于龈沟液样品量少，待测液中的有效成分更是希罕，很难保证酶联板的均一性和透光性，使用分光光度法限制了测定的精密度和检测限，容易出现假阴性结果，目前尚没有解决上述问题的有效方法。

微纳米尺度的微电极，具有许多常规电极所不能比拟的电学特性，如传质快、电流密度大、反应活性高，此外还具有奥姆降低、时间常数小等特点，在纳米生物传感器、微量痕量检测、单细胞生化分析等领域显示出巨大的应用潜力。但是在牙本质磷蛋白生化检测领域尚无获得应用。

发明内容

本发明的目的是针对传统分光光度酶联免疫方法检测限低、精度差，无法满足牙本质磷蛋白的精确检测要求而提供一种基于三维微柱阵列结构工作电极的牙本质磷蛋白检测装置及检测方法。

一种牙本质磷蛋白的生化检测装置，该装置由电解池1，外加电源2与检测仪表3连接构成，其特征在于，所述生化检测装置的工作电极6为具有三维微柱阵列结构的金属电极；参比电极7为具有恒定电位的饱和甘汞电极；辅助电极8为铂电极，辅助电极8通过精密电阻9与外加电源2连接；检测仪表3由示波管10、垂直偏向放大器11和水平偏向放大器12构成，其中微柱的材质为金、银、镍或铂。

所述电解池中聚苯乙烯容器4内装入待测样品溶液5，由工作电极6、参比电极7以及辅助电极8构成的三电极体系的下部浸泡在待测样品溶液5液面以下，外加电源2与工作电极6及辅助电极8连接并在两电极之间产生一个-0.78V电位，相对于参比电极为0而言；垂直偏向放大器11则连接于电阻9的两端，可测量流过电阻9的电流大小，水平偏向放大器12分别与工作电极6及参比电极7连接，测量二者之间的电压变化。

一种牙本质磷蛋白的生化检测方法，其特征在于，所述牙本质磷蛋白的生化检测方法是在牙本质磷蛋白的生化检测装置中进行的，包括牙本质磷蛋白的提取及纯化和电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白的含量两个步骤；

1)牙本质磷蛋白的提取和纯化：采用“滤纸吸着法”提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，并采用“蛋白提取液纯化法”提纯：取样前，首先清洁口腔牙面并吹干将吸潮试纸尖端紧贴于牙齿的颊舌侧牙面的龈沟边缘，放置30秒以上，取出后放入离心密封管作待测样品，并于-75℃保存；待测样品提纯是在待测样品中加入15μl蛋白提取液，冰浴25分钟，于4℃下15000转/分钟离心10分钟后，提取30μl上清液，加入等量蛋白上样液，煮沸并冷却，于-20℃保存待测；其中

蛋白提取液配制是：先以300～500ml蒸馏水溶解60.57g三羟甲基氨基甲烷，加入HCl后，用浓度为1mol/L的HCl或浓度为1mol/L的NaOH，将pH调至7～8，最后蒸馏水加至1000ml，得到浓度为0.5mol/L的蛋白提取液，在4℃冰箱中保存备用；

蛋白上样液配制是：先量取120ml上述0.5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml质量浓度比为10％的十二烷基磺酸钠水溶液，500ml品质浓度比为50％的甘油水溶液，50ml的2-巯基乙醇，100ml品质浓度比为1％的溴酚兰水溶液，最后蒸馏水加至1000ml，在4℃冰箱中保存备用；

2)电化学酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白含量：