[发明专利]nisin-rbLF-N融合基因以及表达该融合基因的毕赤酵母工程菌

权利要求书

1.一种融合基因，其含有编码乳酸链球菌素的nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。

2.如权利要求1所述的融合基因，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。

3.含有权利要求1或2所述融合基因的载体。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其出发载体为pPIC9K。

5.含有权利要求3或4所述载体的工程菌。

6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，其为毕赤酵母。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，其为毕赤酵母GS115。

8.构建权利要求7所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，将优化后的nisin基因克隆于pMD19-T载体，以合成的pMD19-T/nisin质粒为模板，用引物F1、R1进行PCR扩增nisin基因，纯化回收PCR产物；以从牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增rbLF-N基因，纯化回收PCR产物；以纯化回收后的nisin基因和rbLF-N基因为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因，纯化回收PCR产物；

其中，F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’；

F2：5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’；

R2：5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’；

2)将步骤1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到载体pPIC9K中；

3)将步骤2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pPIC9K载体转入毕赤酵母GS115中，然后进行重组克隆的筛选，获得重组毕赤酵母GS115工程菌，冷冻保存。

9.权利要求7所述工程菌的诱导培养方法，包括如下步骤：

1)将重组酵母冻存菌种接于YPD平板上活化，28℃培养2d，至长出单菌落；

2)挑取一活化的单菌落于200mL BMGY液体培养基中，于30℃，250rpm培养，直至培养基的OD₆₀₀达到2.0～6.0；

3)6000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗涤菌体1～2次；

4)将菌体转移至200mL BMMY诱导培养基中，于28～30℃，200rpm诱导培养1～2d。

10.如权利要求9所述的诱导培养方法，其特征在于，步骤4)的诱导培养温度为28℃，诱导培养时间为2d。