[发明专利]一种表达弹性蛋白酶2B的基因工程菌、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达人源弹性蛋白酶2B的基因工程菌、其构建方法及应用。

背景技术

弹性蛋白酶(elastase)是以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的一类广谱蛋白水解酶，在食品、医药、日化及环保领域有重要的开发前景。目前国内弹性蛋白酶的生产方法主要是从动物的胰脏中提取，受到脏器材料及生产工艺的限制，成本较高，产量较低，大大落后于市场需求，限制了弹性蛋白酶的应用推广。国内外广泛开展利用微生物发酵生产弹性蛋白酶，在一定程度上缓解了工业用酶，如肉类嫩化剂、化妆品添加剂等方面的需求，但作为医用生化药物仍然有很大的局限，这主要是由于微生物发酵生产的弹性蛋白酶在生物安全性及毒理方面还有一定的不足，另外不同微生物来源的弹性蛋白酶性质有一定差别，距离医用生化药物商品生产有一定的距离。

本发明利用基因工程技术，通过反转录克隆了人肾脏组织中的弹性蛋白酶2B(elastase 2B，ELA2B)基因，利用大肠杆菌表达系统对其进行表达，使大规模生产安全的人源弹性蛋白酶成为可能，同时为人源弹性蛋白酶的结构和性质研究提供了实验材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效表达人源重组弹性蛋白酶2B的基因工程菌。

本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明的进一步目的是提供上述基因工程菌在生产人源重组弹性蛋白酶2B中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种表达人源弹性蛋白酶2B的基因工程菌，其出发菌株为大肠杆菌。优选地，其出发菌株为大肠杆菌BL21。

上述基因工程菌的构建方法，其包括步骤：1)从人体肾脏组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到ELA2B基因；2)将步骤1)中得到的ELA2B基因插入到表达载体中；3)将步骤2)中构建的表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌。

前述的方法，其中所述表达载体的出发载体为pET30a。

前述的方法，其中所述ELA2B基因具有Seq ID No：1所示的核苷酸序列。

为了获得原核表达载体质粒，本发明通过反转录人体肾组织得到ELA2B基因，用PCR方法在5’端加上GGATCC以构成BamH I酶切位点，3’端加上AAGCTTG以构成Hind III酶切位点，然后经BamHI及Hind III两种酶消化后，即可直接克隆至pET30a质粒，得到pET30a/ELA2B质粒。

本发明以pET30a作为表达载体，是由于pET系统是有史以来在大肠杆菌(E.coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导表达。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。此外pET30a表达系统能在所表达的外源蛋白的N端加上His蛋白标签，可以用Ni柱洗脱的方法进行纯化，从而极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，非常适合大规模目的蛋白的制备。

将上述pET30a/ELA2B原核表达载体转入大肠杆菌BL21，然后进行重组克隆的筛选，从而获得大肠杆菌工程菌。所述工程菌的诱导培养方法包括：待工程菌于37℃培养至对数生长期后，按3～5v/v％的接种量将菌液接种于LB液体培养基中，当OD₆₀₀达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，在温度37℃，200rpm的条件下诱导培养4h。

本发明的诱导培养条件中，在IPTG浓度为1mmol/L的诱导条件下，目的蛋白可以大量表达；随着IPTG浓度的增加，蛋白表达量增加不明显；诱导温度对目的蛋白的诱导表达量也有一定影响，本发明研究了在较低温度(15℃、20℃)及较高温度(30℃、37℃)下目的蛋白在菌体裂解液上清和包涵体中的表达情况，当诱导温度为15℃或20℃时，人源ELA2B目的蛋白有可溶形式表达；诱导温度为30℃或37℃时，目的蛋白几乎均以包涵体的形式存在；从蛋白表达的总量上看，37℃时得到的目的蛋白是最多的；目的蛋白的诱导表达量随着诱导时间的增加而增加，当诱导时间达到4h后目的蛋白的表达量趋于稳定。

为了分离纯化人源ELA2B蛋白，本发明还提供了由上述工程菌所表达的人源ELA2B蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，破碎菌体，提取并溶解含有ELA2B蛋白的包涵体；