[发明专利]一种溶水性VI人胶原蛋白多肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，具体涉及通过基因工程制备一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白是结缔组织结构中极其重要的蛋白。在人体中主要存在于皮肤、骨、软骨、牙齿、肌键、韧带和血管中，由于胶原蛋白固有的生物相容性、生物可降解性以及促进细胞生长等功能，使其在医药、美容、化妆品、食品等领域的用途不断拓大。

当前生产胶原蛋白主要的方法是利用酸、碱水解法从动物结缔组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)中提取，而且提取过程中易丧失部分生物活性，提取的产品成份也非常复杂，也有很多病毒隐患，从而极大地限制了胶原蛋白在医药等诸多领域的广泛应用。科学家们曾想法从人胎盘中获取胶原蛋白，但是，该研究受到世界人权组织及FDA的阻止。其次，利用化学法合成的胶原蛋白往往不具有生物活性结构，并且技术较为复杂，成本较高。

为了能充分利用胶原蛋白的优良性能，并避免动物源的病毒高风险，诸多学者利用基因工程技术，选用各种宿主细胞，如转基因鼠、昆虫、转基因蚕、转基因烟草、大肠杆菌、酵母等生产重组人胶原蛋白，其胶原蛋白产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点，解决了传统提取方法存在的如疯牛病阮病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排斥性等。可见利用基因工程技术生产重组胶原蛋白是近几年来该方面的热点研究领域。

目前人胶原蛋白的生产主要集中在I型、II型、III型和IV型，对于VI型胶原蛋白报道仅限于其结构和性质等方面的研究。VI型胶原蛋白是Chung等于1976年从人大动脉的胃蛋白酶水解物中首次发现，其显著特征是分子量大，半胱氨酸含量高^[1]。有研究表明，VI型胶原蛋白的mRNA水平在皮肤的松弛成纤维细胞系中表达量会提高，VI型胶原蛋白可能与皮肤松弛的变化有关^[2]。Furuto和Miller从胎盘组织中分离了VI型胶原蛋白并对其结构进行了初步描述^[3]。目前，VI型人胶原蛋白的的生产未见有报道，胎盘组织方法由于病原微生物的易感染及低提取率和原料的不易获得大大限制了胶原蛋白的大规模制备。(参考文献[1].将挺大，张春萍。胶原蛋白【M】北京：化学工业出版社，2001[2].AtsushiHatamochi，Masami Arakawa，Kenichi Mori，Yasuji Mori，Hiroaki Ueki，Hidekatsu Yoshiokab.Increased expression of type VI collagen genesin cutis laxa fibroblasts.Journal of Dermatological Science 11(1996)97-103[3]王荣春，徐德昌，胶原蛋白与VI型胶原蛋白的结构概述，生物信息学2004，4，30-34)

发明内容

为了解决VI型人胶原蛋白现有制备技术存在的问题，本发明旨在提供一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，采用基因工程技术制备溶水性VI型人胶原蛋白多肽，包括将溶水性VI型人胶原蛋白多肽编码基因连入表达载体；重组表达载体转染大肠杆菌宿主细胞构建工程菌；诱导工程菌表达含有VI型人胶原多肽的蛋白产物；分别建立大肠肝菌工程菌发酵及目的蛋白纯化工艺。

本发明通过如下方法实现：

I.以含有人COLVIA2 mRNA基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板，应用PCR克隆出溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因

(1)从含有质粒pCMV-SPORT6的大肠杆菌中制备质粒DNA：遵循Omega公司的质粒提取试剂盒的说明书来提取制备。

(2)根据基因库编号BC065509.1的人类胶原蛋白VIA2型全长mRNA序列，设计带酶切位点ECORI，SalI的上下游引物如下：

P1 COL6A2ECORI为5’atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3’

P2 COL6A2SalI为5’atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3’

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃再延伸7min。