[发明专利]用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs的方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白工程与细胞工程领域，尤其涉及一种利用西方蜜蜂(Apis mellifera)，尤其是意大利蜜蜂(Apis mellifera mellifer)王浆制备的功能蛋白RJCPs的方法，本发明还涉及该蛋白应用于动物细胞培养的具体方法。

背景技术

动物细胞，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和人体细胞的大规模培养是现代生物技术的重大发展方向之一，在如单克隆抗体、组织型纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、干扰素等生物制品的生产中已成为起支柱作用的技术，特别是近几年一些贵重的生物制品可来源于异倍体细胞、肿瘤组织源的细胞及重组细胞。随着动物细胞培养系统气升式反应器、中空纤维系统、微载体等工业化规模的兴起，相应地无血清培养日益受到关注，人们正寻求胎牛血清的替代物以降低生产成本。

20世纪50年代初，Eagle发明了含有氨基酸、维生素、碳水化合物和矿物质等的基础培养基。但该培养基仍然需要体液作支持。当时不清楚体液的作用，只知道其为细胞生长所必需。后来，这种培养基在使用20％的动物血清替代体液后，得到了广泛的使用，人们随之了解到，胎牛血清含有最完全的细胞培养所需的营养成分和因子，增加牛血清后的培养基具有足够的生长因子。目前最常用的是添加10-20％胎牛血清的培养基。

目前，牛血清是疫苗和生物技术产品生产过程中细胞培养不可或缺的原材料，但其质量的高低严重影响产品质量，尤其是受外源因子污染的血清对最终产品的使用者将造成严重威胁。我国的牛血清产品均以宰杀出生后的小牛获取血清的模式生产，这种小牛感染BVDV和其他外源病毒的机率很高。此外，由于不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差；制品中残留的牛血清易引起被接种者对血清的过敏反应。虽然目前将一些细胞的培养设计成无血清的培养体系可避免这些问题，但绝大多数的培养体系仍在使用添加血清的培养基。

据1997年出版的《Medical and healthcare market place guide》估测，欧美市场每年用于生物药物和疫苗生产的胎牛血清为50万升，价值10亿美元，而使用胎牛血清后所产出的产值为40亿美元，可见目前生物技术产品和病毒性疫苗的生产大多数仍依靠细胞培养来表达产物和扩增病毒。虽然近年来无血清培养基正在扩大使用，并证明是可行的，但是需要复杂的设备，而且仅限于特殊的细胞类型。尽管人们已认识到无血清培养基有许多优点，但应用无血清培养基培养正常细胞的目标很难达到，目前仅用于丧失贴壁功能、具有肿瘤特性的细胞的悬浮培养。因此，未来一段时间内仍不得不采用常规添加牛血清生产生物制品。

以昆虫细胞为例，目前昆虫细胞培养一般是在含有10％～20％的牛血清培养基中生长，由于血清成本高、来源少，批量间的质量不稳定、重复性差，限制了昆虫细胞大规模培养的发展及应用，而且血清成份复杂，是支原体和其它异源病毒污染的重要来源，为重组蛋白的下游处理带来了困难，发展无血清培养基是解决这些困难的关键技术之一。而进口的无血清培养基价格昂贵，不利于开展细胞大规模培养工作，因此在国内发展无血清培养，寻找使用可替代血清的多肽或蛋白生长因子具有重要的经济意义和理论意义。

据文献报道，含有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清蛋白等的蛋白质含有11种必需氨基酸和7种非必需氨基酸，是目前已知的、具有促细胞生长活性的细胞生长因子。如β-乳球蛋白含有两种促细胞生长因子，分子量约4-40kDa，在0.3％-0.5％内对细胞生长有明显的刺激作用，而当其浓度低于0.05％时不能促进细胞增殖。目前已有很多采用重组基因工程方法表达人体表皮细胞生长因子的研究报道，但国内尚未见利用蜂王浆制备细胞生长因子的研究报道。