[发明专利]木聚糖酶的基因、质粒、菌株及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种耐高温耐强碱的木聚糖酶的基因、生产菌株及该基因编码的木聚糖酶在纸浆漂白的应用。

背景技术

造纸工业是支撑我国国民经济的重要产业之一，但也是我国重要的工业污染源之一。这是因为目前制浆造纸工业仍主要采用硫酸盐法制浆和氯漂技术，含氯漂剂是造纸工业中普遍使用的漂白剂。长期以来，人们一直认为氯是纸浆漂白中最经济有效的漂白剂。但在传统的氯漂工艺中，漂白废水中含有大量对人体有害的物质，其中以二噁英为代表的有机氯化物对环境的危害尤为严重，它们具有强致癌作用，带来了严重的环境污染。随着全世界范围内对纸和纸板不断增加的需求和越来越严的造纸废液排放的要求，加剧了漂白工艺向少氯和无氯漂白的方向发展。

在1986年国际纸浆造纸工业生物技术研讨会上，芬兰科学家Viikari等首次报道应用木聚糖酶处理浆料能改善其漂白性能，减少氯气使用用量，提高纸浆白度的。随后多项实验证实木聚糖酶用于纸浆预漂能有效降低漂白化学用品的消耗量，提高纸浆强度。为了获得最佳助漂效果，从微生物中提取的木聚糖酶要求无或低纤维素酶活活性，因为纤维素酶活性会造成纸浆中纤维素的损失，降低纸浆的质量和增加排放物的处理成本。

制浆之后及在用木聚糖酶处理纸浆之前，纸浆处于大约高温(55-70℃)及在高碱性pH下(pH9-11)。高温和碱性状态对木聚糖酶制剂提出了严格的要求。许多可商购的野生型木聚糖酶的缺点是这些酶呈现酸性的最佳pH及大约55℃的最佳温度。如用这些木聚糖酶进行漂白，纸浆必须酸化为使用的特异性木聚糖酶最佳pH相近的pH。另外，热纸浆必须冷却至接近选择的木聚糖酶的酶活性的最佳温度。针对木聚糖酶处理而降低纸浆温度降低了随后化学漂白的效力，而酸化纸浆也需要使用大量酸。另外，加入酸产生侵蚀，对反应塔提出了新的要求。因此在接近纸浆原漂白条件的温度和pH条件下活性最佳的木聚糖酶在纸浆生产中最为理想。

200610037416.6号中国专利申请公开了一种高效表达木聚糖酶基因的方法及在纸浆漂白工艺中的应用。该专利申请中的木聚糖酶的酶活为526IU/mL，在75℃、pH9.0时的半衰期为45分钟。该木聚糖酶虽然在一定程度上能耐高温和耐碱，但高温高碱的条件下半衰期短，不能满足纸浆漂白工艺中处理时间1-1.5小时的要求。

发明内容

本发明的目的之一在于解决现有技术的不足之处而提供一种能够编码耐高温、耐碱、高效稳定的木聚糖酶的基因。

本发明目的可以通过以下技术措施实现：一种木聚糖酶的基因，所述的木聚糖酶基因xyn的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。

Gashaw Mamo等在2006年首次克隆了嗜盐芽孢杆菌(Bcillus halodurans S7)的木聚糖酶A(xyn)基因，并将其在大肠杆菌中成功表达；同年他们报道了其主要的酶学性质，发现该木聚糖酶具有耐热性、耐碱性，且不含纤维素酶活，可能具有应用于造纸工业的理想特性。但此后并没有看到关于该酶应用于生产的报道。其原因可能在于，其一，在原始菌株的表达量低；其二，尽管Gashaw Mamo等将其基因在大肠杆菌中表达，但表达的酶活相对较低，分泌的酶活为5.1U/mL，该酶不能完全分泌，有部分分布在在胞内及周质空间而且表达量不高，提取酶时必须进行破壁处理，因而限制了其作为工业用酶制剂的进一步开发。

本发明采用密码子优化、基因全合成等方法，实现对S7-xyn(嗜盐芽孢杆菌S7的木聚糖酶A)基因的分子改造和人工组建，得到一种能够高效表达木聚糖酶的基因。发明人根据美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的S7-xyn基因序列，对序列进行优化，替换成毕赤酵母偏好的密码子，再将优化后的基因序列用DNAWORKS软件(http://mcll.ncifcrf.gov/lukowski.html)，设计全基因合成的引物，设计了34条引物，采用两步法(PCR-base two-step DNA synthesis PTDS)合成S7-xyn基因序列，得到的木聚糖酶基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。