[发明专利]一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

李痘病毒(Plum pox virus，PPV)是马铃薯Y病毒属成员，病毒粒子呈弯曲杆状，大小为700nm×11nm，是我国的检疫性有害生物。自然条件下，PPV寄主范围广，可侵染46种木本植物和150种草本植物，李、桃、杏和樱桃等多种核果类果树均可受害。李痘病毒分布范围极广，在美国、加拿大、日本、埃及、印度、叙利亚、土耳其、智利、及欧洲许多国家均有报道。李痘病毒可经蚜虫以非持久性方式传播，扩散速度快，在短时间内即可能给国内整个核果类产业的发展带来灾难性后果。加强该病毒的检疫监测，对于防止PPV传入具有极为重要的意义。

目前，检测PPV的常用方法主要是ELISA、普通RT-PCR、多重PCR等方法，但这些方法有的存在假阳性问题，有的难以确定起始模板的拷贝数。本领域迫切需要特异性更强、灵敏度更高、方便准确的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。

本发明提供的辅助鉴定李痘病毒的试剂盒，包括特异引物对；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

所述试剂盒还可包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特异探针可为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端连接有荧光报告基团FAM，3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。

特异引物对如下：

上游引物(F)：5’-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3’(序列表的序列1)；

下游引物(R)：5’-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3’(序列表的序列2)。

特异探针(TaqMan探针)(核苷酸序列为序列表的序列3)如下：

5’-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3’。

所述试剂盒还可以包括其它PCR常规试剂、RNA提取试剂和反转录常规试剂等。

所述试剂盒可用于辅助鉴定李痘病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的非李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。所述待测病毒可为李痘病毒(PPV)、马铃薯X病毒(PVX)或马铃薯Y病毒(PVY)

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测样本中含有李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测样本中不含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对。

本发明还提供另一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对和特异探针进行实时荧光PCR，根据扩增曲线判断待测样本中是否含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记有荧光淬灭基团Eclipse。实时荧光定量PCR技术具有定量、高特异性、高敏感性、高通量等优点，非常适用于病毒的检测。如果扩增曲线均处于阈值以下，待测样本不含有李痘病毒；如果部分扩增曲线处于阈值以上，待测样本含有李痘病毒。

本发明还保护一种辅助检测李痘病毒的特异引物对，为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

本发明还保护一种辅助检测李痘病毒的特异探针，所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述探针具体可为TaqMan探针。

采用本发明提供的试剂盒，用引物对与特异性TaqMan探针进行实时荧光PCR检测，根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产生荧光信号值的大小，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。

与现有技术比较，本发明的优点如下：

1)检测结果准确性高。在开发与检验特异引物对与特异探针的过程中，检测准确率达95％以上。