[发明专利]登革病毒病毒样颗粒的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及登革病毒病毒样颗粒的制备方法及应用。

背景技术

登革病毒(DENV)感染是当今人类中流行最广的虫媒病毒病。登革病毒通过伊蚊传播，如今几乎在所有的热带、亚热带地区都有分布。据WHO估计，全球有25～30亿人口面临感染登革病毒的危险，每年大约有5千万到1亿登革热(Dengue fever DF)病例发生，患者表现出高热、头痛、肌痛、关节痛及皮疹等症状；这其中有50万例发展成更为严重的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome DSS)，每年因登革病毒感染死亡的人数是2.5万。近年来随着全球气候变暖及旅游事业的发展，其传播媒介伊蚊的地理分布范围不断扩大，登革病毒感染在全世界范围内广泛播散，已成为世界上分布最广、发病人数最多、危害最大的重要虫媒病毒病之一。

但是，关于登革病毒及其感染还有许多迄今未了解和解决的问题，以至登革病毒感染的防治缺乏非常有效的措施，特别是登革病毒疫苗研究没有取得重大进展。登革病毒有4个血清型，4种血清型病毒都可以导致发病。目前的研究表明，针对登革病毒某一血清型的抗体对其他血清型无长期保护作用，当再次感染异型病毒时，会由于抗体依赖增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)而使患者产生更为严重的登革出血热和登革休克综合征。所以一种成功的登革疫苗必须对4型登革病毒都能够产生保护性免疫，能够预防登革病毒感染所引起的疾病。WHO已将登革病毒疫苗确立为优先发展的疫苗之一。而登革病毒疫苗也一直是各国学者关注的焦点，将近60年来，研制登革疫苗的努力从未停止，但目前仍没有登革疫苗用于临床。

伴随着分子生物学的飞速发展，产生了一些研究登革疫苗的新思路，病毒样颗粒疫苗就是其中的一种。病毒样颗粒(VLPs)是一种不含病毒核酸的假病毒颗粒，完全没有感染性成分，只是具有灭活病毒或减毒活疫苗病毒颗粒衣壳的真实构象，它以一个更接近真实构象的形式呈递病毒抗原，更容易被机体免疫系统识别，并且没有病毒毒力回复或病毒基因重组或重配的可能。正由于它具有很强的免疫原性及很好的安全性，因而被认为是一个非常好的疫苗候选物。

登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员，为单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5′-NCR-C-PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR-3′，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中E基因编码的E蛋白为病毒表面包膜糖蛋白，具有与细胞表面受体结合，介导膜融合，诱导产生中和抗体等重要生物学功能，是病毒最重要的抗原成份。PrM基因编码的PrM/M蛋白也被认为是诱导产生中和抗体的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。有报道称，对于黄病毒属成员，共同表达prM蛋白及E蛋白可形成病毒样颗粒。

由于prM蛋白及E蛋白均为糖蛋白，而E.coli表达系统本身具有局限性，即缺少蛋白质后修饰功能，使得表达产物不能糖基化。因此，在真核表达系统中表达prM蛋白及E蛋白有利于蛋白功能的实现。目前，国内研究中尚未发现有在真核系统中分泌表达四型登革病毒病毒样颗粒研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供登革病毒病毒样颗粒的制备方法。

本发明的另一目的是提供可分泌表达DENV1-4病毒样颗粒的真核系统重组载体。

本发明的进一步目的是提供登革病毒病毒样颗粒在预防登革病毒所引起的疾病中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的编码登革病毒病毒样颗粒的基因，其具有Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4或SeqID No.5所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。例如在SeqIDNo.1-5中编码JESS信号肽序列的区段，将编码第20-24位氨基酸序列的GCTTGTGCAGGAGCC替换为CCACAGGCACAGGCC。

本发明还提供含有编码登革病毒病毒样颗粒的基因的载体。优选地，所述载体为真核系统表达载体。更优选地，所述载体为pcDNA5/FRT。

本发明还提供含有上述重组载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。更优选地，所述宿主细胞为293T细胞。

本发明还提供上述基因编码的登革病毒病毒样颗粒的制备方法，其包括步骤：