[发明专利]一种重金属酶标物及其应用

权利要求书

1.一种制备重金属酶标物的方法，包括如下步骤：

(1)将酶活化，得到活化后的酶；

(2)将所述活化后的酶与络合物进行交联反应，得到重金属酶标物；

所述络合物是按照包括如下步骤的方法制备的：

Ⅰ、将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂；

Ⅱ、将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述重氮化的螯合剂的偶联物；

Ⅲ、将金属离子的溶液与所述偶联物混合，进行络合反应，得到所述络合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述活化的方法包括如下步骤：将酶的水溶液与NaIO₄水溶液混合，反应，得到活化的酶；

所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与络合物进行交联反应的方法包括如下步骤：将所述络合物溶于碳酸盐缓冲液中，再加入所述活化后的酶，反应，得到所述重金属酶标物；

所述步骤Ⅰ中，所述重氮化的方法包括如下步骤：将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件包括：温度为0-5℃、避光和时间为15min；所述温度优选为0℃或4℃；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的投料配比为4mg∶2×10^-3mol∶1.2×10^-4mol；

所述步骤Ⅱ中，所述偶联反应的条件包括：温度为4℃-10℃或4℃，pH值为8.5-9.0或8.5，反应时间为4h-24h或4h；所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的投料摩尔比为10∶1；

所述步骤Ⅲ中，所述络合反应的条件包括：温度为25℃、pH值为7.5和时间为12h；所述偶联物与所述金属离子的投料摩尔比为1∶20。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述活化的方法中，所述反应的温度为25℃，反应的时间为20min；

所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为2小时，所述反应的PH值为8.0；

所述步骤(1)中，所述活化的方法中，在所述反应后，包括如下用乙二醇终止反应的步骤：向所述反应的体系中加入乙二醇水溶液，25℃搅拌反应10min；其中乙二醇与NaIO₄的投料摩尔比为1∶1；

所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，在所述反应后，包括如下步骤：向所述反应的体系中加入NaBH₄，4℃搅拌反应2小时。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述重金属为铜；所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述酶为辣根过氧化物酶。

5.由权利要求1-4中任一所述方法得到的重金属酶标物。

6.一种重金属酶标物，是络合物与酶通过共价键形成的交联物；所述络合物为螯合剂与载体蛋白通过共价键连接形成的偶联物再与重金属通过配位键连接形成的络合物。

7.一种用于检测样品中是否含有重金属的酶联免疫试剂盒，包括包被原和权利要求5或6所述重金属酶标物；所述包被原为抗待检重金属的抗体；所述重金属酶标物中的重金属与所述待检重金属相同。