[发明专利]人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种及其制备方法

权利要求书

1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种，其特征在于将狂犬病固定毒CTN-1V₅株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，其保藏号为CGMCC No.3989。

2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种病毒滴度≥7.0lgLD50/ml。

3.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种在人二倍体细胞(KMB17)传代，其G蛋白基因具有稳定性。

4.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于液体毒种-60℃以下可保存3年半以上，毒种真空冷冻干燥后于-60℃以下长期保存。

5.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于具体制备方法步骤为

1)用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。

2)将狂犬病固定毒CTN-1V₅株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为CTN-DK株。传代方法为细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V₅株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。

3)当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。

4)CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。

5)病毒的接种方式是悬浮细胞接种法，病毒接种剂量为0.005～1.0MOI，培养温度为32℃～37℃，PH7.2～8.0，病毒收获时间为接种病毒后2～20天。

6.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于人二倍体细胞(KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由Eagle液、乳蛋白及一定量的新生牛血清组成。