[发明专利]一种制备基因传输载体碳酸钙纳米的方法

说明书

所属技术领域：

该方法制备的纳米是一种无毒、生物相容性好、可生物降解，并能够用作基因传输载体，适用于生物制药及肿瘤基因治疗领域。 

背景技术：

载体问题一直是基因治疗中亟待解决的关键问题之一，理想的转染载体应具有安全性、高效性及稳定性：①安全性一方面是指载体本身不具备免疫原性，对机体无毒，另一方面指载体不会随机与宿主的染色体整合，诱发突变等；②高效性是指可将目的基因靶向输送到肿瘤组织且能感染大量的细胞；③稳定性是指载体可介导目的基因整合至宿主染色体的特异位点或能以附加体形式稳定存在，目的基因可长期表达而不需反复转染。 

目前基因治疗的临床试验多是利用病毒载体，虽然转染率高，但存在其自身的缺陷，如最初使用的逆转录病毒载体，不能装载大片段DNA，且可随机整合至宿主的染色体，利用逆转录病毒为载体介导的基因治疗曾导致多起白血病的发生；现在临床试验中常用的腺病毒，虽然不会随机整合到宿主基因组中，不具备致瘤性，但是其编码蛋白可激活机体免疫反应，且由于不整合到染色体组，随着细胞的分裂而丢失，不能长期稳定表达。此外尚有腺相关病毒载体、慢病毒载体等，都有一定的局限性。 

目前有关非病毒载体的研究越来越广泛，非病毒性载体虽然转染效率不如病毒载体高，但是安全、制备简单，且携带外源基因的容量较大。非病毒载体包括脂质体、阳离子多聚物及纳米颗粒等。脂质体性质稳定，无插入突变的危险，它在将核酸导入细胞后即被降解，因而无毒性，无免疫原性，可在体内多次重复使用而不引起机体的免疫反应，而且制备容易、成本较低；但其缺点是体内转染效率低，临床应用受到一定限制，鉴于现有病毒载体和非病毒载体存在的缺陷，研制新型的非病毒载体已经成为了研究的热点，纳米颗粒因为具有小尺寸效应，表面效应，随着颗粒直径变小，比表面积将会显著增大，故具有很高的化学活性，因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。研究表明，纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒，在短时间内，不会很快被吞噬细胞清除，从而更多的渗出到血管外，组织间隙，延长与细胞的接触时间，提高转染效率；通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解，但纳米基因载体有浓缩，保护DNA功能，与DNA形成一致密的结构，使DNA不被核酸酶消化降解。 

目前，采用的纳米生物材料大致分为有机材料和无机材料两大类，前者有多聚糖、高分子聚合物等，后者主要集中在对石英、羟基磷灰石、磁铁粉、陶瓷、碳粒、硅氧化物及各种金属或合金的研究。高分子聚合材料作为纳米载体的研究越来越受到重视，其在基因的输送中有许多的优越性，如能保护核苷酸的降解、有助于核苷酸转染细胞，并可起到定位作用，能靶向输送核苷酸，且可控制DNA的释放速率，延长其在体内的作用时间等。生物降解性是药物载体或基因载体的重要特征之一，通过降解，载体与药物/基因片段定向进入靶细胞之后，表层的载体被生物降解，芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了药物在其他组织中释放。 

发明内容

本项目利用化学方法制备一种50nm左右大小、分散均匀的碳酸钙纳米颗粒，碳酸钙纳米颗粒能与质粒DNA有效结合，通过复合体吸附在细胞膜上并进入细胞内，增加进入细胞内DNA量，提高基因转染的效 率，并且质粒DNA与纳米颗粒形成的复合体能有效的抵抗血清中酶类对DNA分子的降解，有效的保护DNA分子的完整性。 

本新型纳米所采用的技术方案 

本技术采用在表面活性剂作用下，(氯化钙与碳酸钠)的浓度比例为2∶1，温度控制在30℃，搅拌速度为350rpm，化学合成制备的碳酸钙纳米颗粒大小在50nm左右，分散较好，本方法制备的过程中工艺要求较高；在改变各反应物的浓度、反应过程中的温度会改变生成颗粒的大小及均匀度，以及反应合成时间、搅拌的速度的改变也同样影响制备碳酸钙纳米的特性，我们经过反复的制备和检测后，已基本形成较完善的制备工艺。 

本新型载体的有益效果 

作为基因转染的载体必须要求载体能与DNA结合，并且能带上完整的DNA进入细胞内，使外源基因得到有效的表达。碳酸钙纳米颗粒与带负电荷的DNA结合；在中性的环境下，DNA能与碳酸钙颗粒形成复合体，并且DNA与颗粒的结合形成复合体后能保护DNA不被血清降解，这对于体外细胞的培养及体内多酶环境具有重要的意义；作为基因转染的载体要求对细胞、机体无毒。人体骨骼的主要组成成份为钙、磷，碳酸钙是可降解的无机材料，在体内可降解为钙与磷，被骨质吸收，对机体基本无毒。应此该碳酸钙纳米可能作为基因转染的有效载体之一，在肿瘤的基因治疗中有着重要的意义，为临床基因治疗提供新的思路。 

具体实施方式