[发明专利]一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段构建芽孢杆菌高效分泌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。

背景技术

芽孢杆菌是一类格兰仕阳性细菌，其很多菌株如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等被用作淀粉酶、蛋白酶等酶制剂的生产，许多产品如中温α-淀粉酶、1398蛋白酶等被长期用于食品加工。芽孢杆菌还具有严格好氧生长的特点，因此一般不具有致病性，是一类比较安全的微生物。除具有较高的安全性外，芽孢杆菌还具有向细胞外大量分泌蛋白质的能力，因此也是一类表达外源蛋白的理想宿主菌。

中温α-淀粉酶的工业生产菌株主要为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，目前我国酶制剂工业所采用的生产菌株是60年代中温α-淀粉酶生产菌株BF7658基础上获得的，为我国酶制剂工业所特有，这一菌株是在野生型解淀粉芽孢杆菌基础上经反复物理化学诱变产生的淀粉酶高产菌株[无锡酶制剂厂.枯草杆菌BF-7658α-淀粉酶高产菌株209的选育和投产.遗传学报，1976，9(3)：216-223.]。在这一淀粉酶高产菌株中，其控制淀粉酶表达的启动子是用于构建芽孢杆菌表达载体的理想材料。本发明所使用的中温α-淀粉酶生产菌株由江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.Jiangnan.edu.cn)提供，其收藏编号为B.amyloliquefaciens CICIM B4311。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：通过基因重组的方法，利用中温α-淀粉酶生产菌株细胞内α-淀粉酶基因的强启动子和信号肽编码区构建一种能控制外源蛋白在芽孢杆菌宿主中高效分泌表达的载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供一种高效分泌表达载体。

本发明的技术方案：一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为pCHA03，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2010199。

所述表达载体pCHA03的构建方法：

(1)制备中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy：以生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列[Palva I.Molecular cloning of alpha-amylase gene fromBacillus amyloliquefaciens and its expression in B.subtilis(J).Gene，1982，19(1)：81-87.]相比，序列SEQ ID NO：1在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T；

(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02：它含有芽孢杆菌复制元件ori-pama，大肠杆菌复制元件pMB1 ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基因tet；

该大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建步骤如下：

第一步：以大肠杆菌质粒pBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMB1 ori；

第二步：以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300PLK[Ishiwa H andShibahara-Sone H.New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis.IV.The nucleotide sequence of pHY300PLK and some properties in relation totransformation(J).Jpn J Genet，61：515-528(1986).]为模板，利用PCR方法获得该质粒中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet；

将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02；

(3)步骤(1)中获得的中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤(2)中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03。