[发明专利]携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用。

2.一种建立构建NK4-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体的方法，其特征在于：

2.1目的基因的获取

A NK4基因片段a

以HGFcDNA为模板，聚合酶链反应扩增NK4基因片段a：521bp；

a引物名称及序列：

NK4-Age I-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCA AACTCC

NK4-mut-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG

b PCR反应体系：

  上游引物NK4-Age I-F  0.4ul  下游引物NK4-mut-R  0.4ul  10×buffer  2ul  MgCl₂  0.5ul  DNTPs(2.5mM)  0.8ul  pfu polymerase  0.2ul  Template(10ng/μl)  1ul  ddH₂O  补至20ul

c循环条件：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min；

B NK4基因片段b

a引物名称及序列：以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b：976bp；

NK4-mut-F：CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC

NK4-Age I-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGT ATC

b PCR反应体系：

  上游引物NK4-mut-F  0.4ul  下游引物NK4-AgeI-R  0.4ul  10×buffer  2ul  MgCl₂  0.5ul

  DNTPs(2.5mM)  0.8ul  pfu polymerase  0.2ul  Template(10ng/μl)  1ul  ddH₂O  补至20ul

c循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min；

C以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c

a引物名称及序列：

NK4-AgeI-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGAC CAAACTCC

NK4-AgeI-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC

b PCR反应体系：

  上游引物NK4-AgeI-F  0.4ul  下游引物NK4-AgeI-R  0.4ul  10×buffer  2ul  MgCl₂  0.5ul  DNTPs(2.5mM)  0.8ul  pfu polymerase  0.2ul  Template(10ng/μl)  1ul  ddH₂O  补至20ul

c循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min；

2.2PCR产物回收

取10μl PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人NK4cDNA溶液；

2.3pGC-FU慢病毒表达载体的酶切

限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化；

酶切反应体系：

  纯化的DNA质粒(1ug/μl)  2μl

  10×buffer  5μl  100×BSA  0.5μl  Age I(10U/μl)  1μl  ddH2O  补至50μl

反应条件为37℃，1h；酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50μl灭菌双蒸水中，准备用于构建重组质粒；

2.4目的基因重组慢病毒质粒的构建

用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒，反应条件为23℃，15min，再42℃，15min；

交换反应体系：

                                对照1        对照2        连接组

酶切回收的载体DNA(100ng/μl)    2μl         -            2μl

回收的PCR产物(100ng/μl)        -            2μl         2μl

10×In-Fusio交换酶缓冲液        2μl         2μl         1μl

In-Fusio交换酶酶                0.5μl       0.5μl       0.5μl

ddH₂O                           补至20μl    补至20μl    补至20μl

2.5感受态细胞制备

采用CaCl₂法制备E.coliDH5a感受态细胞：

A从37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养3h，旋转摇床，300转/min；

B在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；

C于4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；

D倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；

E用10ml预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上；

F 4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；

G倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；

H每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀；

I将细胞分装成小份，放于-70℃冻存；

2.6转化

A用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；

B将管放到42℃的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管；

C快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；

D每管加800μlLB培养基，水浴加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min；

E将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO₄和AMP抗性：100ug/ml的LB琼脂培养基上；

F将平板置于室温直至液体被吸收；

G倒置平皿，于37℃培养16h；

H长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序；

2.7阳性克隆的PCR鉴定及测序

A质粒DNA的提取：用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作；

B以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应；

a引物名称及序列：

EGFP-N-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG

NK4-mu t-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG

b反应体系：阴性对照：ddH₂O及空载体自连对照组；阳性对照：GAPDH

c循环条件为：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；结束前72℃延伸6min；

C接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μl送测序，以确保所筛选克隆碱基序列完全正确；

2.8质粒表达检测

pGC-FU-NK4转染293T细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观察；

2.9质粒大量抽提

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC-FU-NK4表达载体、p-Helper1.0和p-Helper2.0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间；

2.10重组慢病毒包装

A、细胞转染：

a转染前24h，用0.25％胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％FBS的高糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％转染；

b转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；

c向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液：pGC-FU载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg，与Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；

d将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min；

e把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；

f室温孵育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；

g将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；

h培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗涤残余的转染混和物，弃去；

i每瓶细胞中加入含10％FBS的H-DMEM细胞培养基25ml，于37℃，5％CO2培养箱内继续培养48h；

B、病毒的收集与浓缩

a收集转染后48h的293T细胞上清液；

b4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；

c以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；

d把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中；

e4000g离心10-15min，至需要的病毒浓缩体积；

f离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；

g将过滤杯倒扣在样品收集杯上；

h转速低于1000g，离心2min，把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液；

i将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定，所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。

3.一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于：

将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数；采用酶联免疫吸附试验及Western blot检测Lenti-NK4转染BMSCs后NK4表达，具体步骤如下：

3.1Lenti-NK4转染BMSCs，确定最佳感染MOI

A用0.125％胰酶+0.02％EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10％FBS的L-DMEM培养基调整细胞密度为以8×10³/cm²，种植于96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱内培养；

B 24h后吸去培养液，PBS洗涤细胞一次，按MOI值为0、1、10、20、50、100加入相应体积的重组慢病毒颗粒(Lenti-NK4)，同时补充5μg/ml的Polybrane及完全培养基至总量为500μl；

C置37℃、5％CO2培养箱内培养10h后，换为正常培养基继续培养，病毒感染24～120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值的BMSCs的培养上清液，离心后-80℃保存，ELISA法检测培养液中NK4含量；收集细胞Western blot检测NK4蛋白表达；

3.2流式细胞仪检测转染率

A转染Lenti-NK4的BMSCs长满约85％时，0.125％胰酶+0.02％EDTA消化，显微镜下控制消化时间；

B弃去消化液，以10％FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶；

C液体移至离心管，1000rpm，离心5min；

D弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×10⁶/ml；

E用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率；

采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。