[发明专利]桔黄假单胞菌的培育方法及应用

权利要求书

1.一种桔黄假单胞菌的培育方法，步骤如下：

(1)试样采集：从上海市嘉定区红薯作物的根际土壤，深度5cm-15cm，采集土样，风干，贮存于塑料袋中，置于冰箱4℃保存备用；

(2)制备培养基：

①KB液体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K₂HPO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、去离子水1L，混合静置；

②固体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K₂HPO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O1.5g、去离子水1L、琼脂18g，混合静置；

③斜面保藏培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母膏5g、琼脂18g、去离子水1L，混合静置；

④真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、去离子水水1L，混合静置；

⑤固体真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂38g、去离子水水1L，混合静置；

(3)抗生素和供试病原真菌：

①抗生素：氨苄青霉素贮存浓度50mg/mL，氯霉素贮存浓度34mg/mL；

②供试病原真菌：油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、玉米小斑病菌Bipolaris maydis；

(4)菌种筛选：

①菌株分离、纯化与保存：

将采集试样放入含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的1/3KB液体富集培养基培养6-8小时；

将富集好的菌液在含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的KB固体培养基上，梯度稀释、平板涂布；将涂布好的KB平板置于28℃培养箱中培养2-3天，挑取单菌落接至新鲜固体培养基上，分离纯化4-6代后保藏于斜面培养基，备用；

②供试菌株平板对峙生长法初筛：

以油菜菌核病菌为指示菌，将分离到的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选；在内径90mm的PDA平板中央接种直径为8mm的油菜菌核病菌菌饼；同时在距菌饼相距25mm的4个角处分别点接4个分离纯化后待测的细菌菌株；对照平板接种病原真菌菌饼，重复试验3次；

将做好的平板置于25℃培养，3-5d内观察待测菌株对油菜菌核病菌的拮抗作用，选择对病原真菌有抑制作用的菌株进行复筛；

③拮抗菌株的复筛：

在病原真菌菌饼两侧距离30mm的位置点接同一个菌株，选取拮抗菌株菌落边缘到病原真菌菌落边缘距离大、抑菌宽带、拮抗作用持久的菌株，备用；

(5)将上述复筛选出的菌种发酵繁殖，方法为：

①制备培养基：蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水1L；

②培养基起始pH7.0；

③将菌种接种到培养基，接种量3％；

④培养基温度25℃；

⑤摇瓶转速200r/min，培养时间60h。

2.一种桔黄假单胞菌在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中的应用。