[发明专利]犬瘟热弱毒疫苗株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及弱毒疫苗株，尤其涉及涉及一株犬瘟热病毒强毒株CDV-YB以及由该强毒株传代致弱的弱毒疫苗株，本发明还涉及该弱毒疫苗株在制备预防或治疗犬瘟热生物制品中的用途，属于犬瘟热的防制领域。

背景技术

犬瘟热是一种犬类等动物的急性传染病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可呈慢性持续性感染，临诊以双相热型、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫肿胀为主要特征。该病自1926年被发现以来几乎呈世界性分布，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疾病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，经济损失惨重。近年来，包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的称猴属和鳍足目海豹科等多种动物均有CD自然发病的报道，甚至人也有CDV感染的病例，并且CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害也越来越大(蔡宝祥.家畜传染病学(第三版).北京：中国农业出版社.2001，347-351.)。

国外为预防与控制该病，已研制出多种商品用单苗与联苗；国内已有犬用五联苗(狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒2型病和细小病毒病)、犬用三联苗(犬瘟热、狂犬病和犬细小病毒)研制成功的报道。哈尔滨兽医研究所也研制成功犬瘟热单苗。但目前以上疫苗存在造价昂贵，抗原针对性不强等缺点，因此，开发一种新型高效的CD疫苗已迫在眉睫。

发明内容

本发明目的之一是提供一株由犬瘟热病毒强毒株传代致弱的弱毒疫苗株(CDV-YBR)。

本发明目的之二是将上述弱毒疫苗株应用于预防或治疗犬瘟热病。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定：本发明对来自吉林省延边地区发病犬，临床上表现为体温升高，眼、鼻流脓性分泌物的自然发病而死的犬，取肠内容物为病料，接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒的分离，并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染及RT-PCR鉴定。结果表明：病料接种CEF细胞产生明显的细胞病变(CPE)，电镜负染观察接毒细胞培养物见有典型的副粘病毒粒子。分离株不凝集鸡和人“O”型红细胞，动物感染试验的接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液，扩增出的片段长为600bp，与预期设计的长度相同，由此确证分离株为犬瘟热病毒，命名为CDV-YB株。

本发明犬瘟热病毒弱毒株(CDV-YBR)的培育：将分离的犬瘟热病毒(CDV-YB株)通过连续接种鸡胚成纤维细胞(CEF)传代至70代，之后转在Vero细胞上传20代，然后继续在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传至105代。在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CEF和Vero细胞。但病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学鉴定、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验，结果验证了培育的CDV-YB弱毒株(CDV-YBR)具有典型的副粘病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。

本发明将所分离的犬瘟热病毒弱毒株(CDV-YBR)提交专利认可机构保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.3810；分类命名为：犬瘟热病毒；保藏时间是：2010年5月14日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将所分离的CDV-YB株通过在CEF和Vero上传代、克隆，培育了CDV-YB致弱毒株(CDV-YBR株)，致弱评价试验证明了致弱毒株培育成功；同时，通过对病毒的形态学观察、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了本发明所培育的CDV-YBR株具有典型的副粘病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染；从免疫效力试验结果可以看出，本发明犬瘟热病毒弱毒疫苗株(CDV-YBR)对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。由此可见，CDV-YBR株具有良好的免疫原性，可以对犬的犬瘟热病毒感染提供较好的免疫保护作用，是理想的疫苗候选毒株，本发明弱毒疫苗株CDV-YBR可制备成单苗或联苗(活疫苗或灭活疫苗)，可有效预防或治疗犬瘟热。本发明弱毒疫苗株CDV-YBR遗传性稳定，有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优点。

附图说明

图1犬瘟热病毒(CDV-YB)分离株的病毒粒子电镜照片。

图2A：犬瘟热病毒(CDV-YB)分离株的荧光照片；B：阴性对照。

图3犬瘟热病毒(CDV-YB)分离株电泳结果；1：M：DL2000 Marker；2：阳性对照3：CDV-YB分离株；4：阴性对照。