[发明专利]一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。

背景技术

目前动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是影响动物性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。化学发光免疫分析(Chemiluminescence analysis，CLlA)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。CLIA不需要外来光源，具有比荧光免疫分析更高的信噪比，比常规的酶联免疫吸附检测方法的抗背景干扰能力强，其灵敏度比ELISA高1至2个数量级，检测范围可达6个数量级，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物质的检测技术。CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成的雌激素，因其能促进蛋白合成，加快增重和骨骼钙化，并减少饲料消耗，被作为动物促生长剂应用于畜禽生产和水产养殖等方面。但许多科学试验证实了己烯雌酚是一种致癌物质，并具有以生殖毒性为主的严重毒副作用对人和动物的健康危害较大，现在欧美、中国等许多国家已禁止将其用于动物饲料中，但在畜牧生产上的常有非法应用的情况，导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。目前，动物组织中己烯雌酚残留的检测方法主要采用气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-联质谱法、酶联免疫法等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。

本发明所提供的检测己烯雌酚的化学发光免疫试剂盒，包括己烯雌酚特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所示：

所述试剂盒还包括发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；

所述试剂盒由己烯雌酚特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。

所述己烯雌酚特异性抗体为己烯雌酚单克隆抗体或己烯雌酚多克隆抗体；

所述己烯雌酚单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3775的对己烯雌酚的单克隆杂交瘤细胞株DES分泌的抗体。

所述标准品溶液中标准品的浓度为0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L或50μg/L，所述标准品为己烯雌酚；

所述发光液由C液和D液组成，发光液C液为过氧化氢；发光液D液为鲁米诺溶液；

所述浓缩洗涤液是将0.05g叠氮化钠和100mL浓度为0.02M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到溶液；

所述浓缩复溶液是将0.1g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.05mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；

所述包被缓冲液是pH值为9.6的浓度为0.03mol/L的碳酸盐缓冲液。

所述封闭液是将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L、pH值为7.4磷酸盐溶液混合得到的溶液。所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白。

所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗鼠抗抗体。

所述包被原是按照如下方法制备得到的：a、将每18mg己烯雌酚半抗原、2.5mL二甲基甲酰胺、15μL三正丁胺和9μL氯甲酸异丁酯混合反应30min，得到的产物溶液称为A液；将每15mg载体蛋白溶于1mL 50％的二甲基甲酰胺水溶液(体积百分含量)中，调节pH至9，得到的产物溶液称为B液；

b、将A液加入到B液，4℃反应4h后，再经过透析得到包被原；

所述己烯雌酚半抗原的结构式如式II所示：

(式II)。

所述己烯雌酚半抗原是按照如下方法制备得到的：