[发明专利]一种提取连翘叶片DNA的方法

权利要求书

1.一种提取连翘叶片DNA的方法，其特征在于：以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I，提取缓冲液I加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液I混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液II，提取缓冲液II加入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的6倍，沉淀物与提取缓冲液II混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，立即加入预热的2×CTAB和β-巯基乙醇，2×CTAB加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，β-巯基乙醇加入量为每0.5g连翘幼嫩叶片原材料加入60-120μL，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4℃下离心10min；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜；4℃下离心5min，收集沉淀，弃去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的2倍，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；每0.5g连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA；

所说的提取缓冲液I是由0.25mol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、0.25mol/LNaCl和余量为水混合均匀制成；所说的提取缓冲液II是由100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L Na₂B₄O₇和余量为水混合均匀制成。

2.根据权利要求1所述的提取连翘叶片DNA的方法，其特征在于：取0.5g连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I 3-5mL，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，弃去上清液，再加入提取缓冲液II 3ml，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，弃去上清液，立即加入3-5mL65℃预热的2×CTAB和60-120μL β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4℃下10000r/min离心10min；取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下12000r/min离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置8-12小时过夜；4℃下8000r/min离心5min，弃去上清液，收集沉淀物，沉淀物用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀物2次或3次，每次1mL，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL 5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA。