[发明专利]指示微生物生长的指示管及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域；更具体地，本发明涉及指示微生物生长的指示管及其应用。

背景技术

临床上致病菌获得能量的基质主要是糖类，通过糖的氧化或酵解释放能量，并以高能磷酸键的形式(ADP、ATP)储存能量。细菌生物氧化的类型分为呼吸与发酵。在生物化过程中，细菌的营养物(如糖)经脱氢酶作用所脱下的氢，需经过一系列中间递氢体(如辅酶I、辅酶II、黄素蛋白等)的传递转运，最后将氢交给受氢体。以无机物为受氢体的生物氧化过程，称为呼吸，其中以分子氧为受氢体的称需氧呼吸；而以无机化合物(如硝酸盐、硫酸盐)为受氢体的称厌氧呼吸。生物氧化中以各种有机物为受氢体的称为发酵，大多数病原菌只进行需氧呼吸或发酵。多数细菌生长发酵时能还原无色的氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)为红色的三苯甲臢(TTF)(如下式)，形成红色集落，三苯甲臢比较稳定，不会被空气中的氧气自动氧化。

细胞的生长或细胞活性的检测经常使用四氮唑MTT(Tetrazolium)法，其原理是活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶与外源性的MTT发生氧化还原反应，被还原成不溶于水的蓝紫色结晶物沉积于细胞内(如下式)，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色臢结晶物，然后酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，就可以间接反映活细胞的数量。

总之，活细胞、细菌生长时均会产生能量代谢，代谢中所需能量，绝大多数是通过生物氧化作用而获得的，生物氧化即在酶的作用下生物细胞内所发生的系列氧化还原反应。发生氧化还原反应就会发生氢质子传递，因此，可通过脱氢酶受氢体又称氧化还原指示剂(Redox indicator)来检测。

氧化还原指示剂是一类脱氢酶受氢体，本质是一类自身具有氧化还原性质的有机试剂，能在特定的电极电位发生明显的颜色变化，其氧化型与还原型具有不同的颜色。

常用的氧化还原指示剂包括：2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，3-(4’，5’-二甲基-2-噻唑基)-2，4-二苯基四氮唑溴化物，噻唑蓝，溴化噻唑蓝四氮唑，噻唑蓝，噻唑兰，3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑，3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物，溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑，3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴代四唑(MTT)，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-四唑氯(2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazolium chloride，INT)，四硝基四氮唑蓝(2，2’，5，5’-tetra-(p-nitrophenyl)-3，3’-(3-dimethoxy-4-diphenylene)-ditetrazoliumchloride，TNBT)、氮四唑蓝(2，2’-di-(p-nitrophenyl)-5，5’-diphenyl-3，3’-dimethoxy-4，4’-diphenylene)-ditetrazolium chloride，NBT)2，2’-p-二亚苯基-3，3’，5，5’-tetraphenylditetrazoliumchloride(neotetrazolium chloride)(NTC)、OTC，PTC，MTC，WST等。

其中，四氮唑类(Tetrazolium)物质是氧化还原指示剂中最常见的试剂。这类氧化还原指示剂能非常灵敏的检测还原性物质，其本身被还原成可见光下可容易辨别的深色臢类物质，在生化检测、细胞培养及常规细菌的培养、鉴定、药敏中得到了广泛的应用。

但是，四氮唑类物质存在以下缺点：

1、四氮唑盐不稳定，对温度、湿度和光较为敏感，极易降解，尤其在水溶液中易生成有色产物，其储存液即使保存在低温(-20℃)环境也不得超过一个月。四氮唑盐的降解或变色大大降低了检测的灵敏度，因此，一般建议四氮唑盐溶液新鲜配制并尽快用完，这严重限制了四氮唑盐的用途，尤其是在需要有一定保质期的培养、鉴定、药敏试剂或产品方面的应用。