[发明专利]运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法有效
| 申请号： | 201010241809.5 | 申请日： | 2010-07-30 |
| 公开（公告）号： | CN102080097A | 公开（公告）日： | 2011-06-01 |
| 发明（设计）人： | 邹少兰;张鲲;洪解放;马媛媛;井欣;张敏华 | 申请（专利权）人： | 天津大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 | 代理人： | 陆艺 |
| 地址： | 300072*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 运动 发酵 单胞菌 穿孔 遗传 操作方法 | ||
1.一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征是包括下述步骤：将待转化DNA通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中或用运动发酵单胞菌无细胞提取液与待转化DNA共同孵育，通过电穿孔将孵育后的DNA转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中；所述运动发酵单胞菌的感受态细胞是将运动发酵单胞菌培养至OD600nm＝0.375～0.420的菌液浓缩100倍而制成；电穿孔操作的参数为：2mm电击杯中感受态细胞体积为80μl～160μl；电场强度为11.0～14.0kV/cm；复苏时间为3h～24h。
2.如权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征是所述运动发酵单胞菌无细胞提取液是用下述方法制成：培养运动发酵单胞菌至OD600＝0.6～1.0的培养液，在8000～12000rpm、4℃、3～6min离心收集菌体，用等体积的冰浴预冷的提取物缓冲液HND洗涤，用培养液体积的1/20到1/10体积的冰浴预冷的提取物缓冲液HND重悬，冰上超声破壁，14000～18000rpm、4℃、8～12min离心，收集上清液，所述提取物缓冲液HND为：pH＝7.0的200mM HEPES，20mM Na2EDTA，5mM DTT。
3.如权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所述用运动发酵单胞菌无细胞提取液与待转化DNA共同孵育为：选100μl反应体系，包括100mMHEPES，pH＝7.0，10mM Na2EDTA，2.5mM DTT，5mM MgCl2，1μM SAM，2～10μg待转化DNA，50μl运动发酵单胞菌无细胞提取液，在37℃、反应2～3小时，纯化，无菌水溶解。
4.如权利要求1、2或3的一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所述运动发酵单胞菌为ZM4、CP4、ATCC10988或ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)。
5.如权利要求1所述的一种运动单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所述2mm电击杯中感受态细胞体积为120μl。
6.如权利要求1所述的一种运动单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所述电场强度为11.75～13.25kV/cm。
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