[发明专利]一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物活性检测方法，特别是涉及一种北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme O’Donnell et T.Aoki)的活性检测方法。

背景技术

北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme O’Donnell etT.Aoki)是引起大豆猝死综合症(Sudden Death Syndrome，简称SDS)的病原菌之一，主要分布在美国、加拿大、阿根廷等国家，在我国还未有该病菌发生危害的报道(吴品珊等，2003)。其病害分布广，危害大，2003年～2005年，该病害对美国大豆产量造成的损失累计达到189万吨(Wrather et al.，2006)。

目前对北美大豆猝死综合症病菌的检测主要是分子生物学方法，如PCR等，这类方法能准确、灵敏、快速的检测出北美大豆猝死综合症病菌，但是不能检测其活性。最新发布的国际标准(ISPM.27)指出，在鉴定进境产品是否携带检疫性有害生物的同时，要对病原菌活性要进行描述。但目前对北美大豆猝死综合症病菌的活性检测分析研究较少，主要采用传统的孢子萌发Colony Forming Units(CFU)计数法，该方法虽然对活性的检测准确、可靠，但检测时间较长。另外，还有基于北美大豆猝死综合症病菌分离培养的分子检测方法，该方法对孢子进行分子检测，可替代对孢子萌发法检测孢子活性，缩短了检测时间，且针对单个孢子即可进行活性检测。其它活性检测方法，如单细胞分析系统活性检测法，虽然检测时间短，最短检测时间仅需20分钟，但对样品中孢子浓度要求较高，至少需菌量1000～2000个孢子，使得该方法在样品稀少时无法进行活性检测。

发明内容

本发明的目的是针对目前北美大豆猝死综合症病菌活性检测中存在的检测时间长或需要孢子量大等问题，提供一种新的检测时间短、所需孢子量极少，甚至1个孢子即可进行的北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种检测北美大豆猝死综合症病菌活性的方法，所述方法采用碘化丙啶为染料对北美大豆猝死综合症病菌孢子进行染色检测。

所述染色方法中染色孢子采用激光扫描共聚焦显微镜观察，活孢子染色后孢子内部没有荧光，而死孢子内部显示红色荧光。

所述激光扫描共聚焦显微镜参数设置包括：荧光信号激发波长为480-500nm，荧光信号发射波长为555-565nm。

所述碘化丙啶的染色浓度为0.000025mmol/L-0.0025mmol/L，优选为0.000025mmol/L-0.0000625mmol/L。

所述碘化丙啶的染色时间为15min-30min，优选为15min。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的活性检测方法用于北美大豆猝死综合症病菌的活性检测，能够有效的区分孢子的死活，从制样到检测完成仅需要30分钟，可以直接对单个孢子的染色情况进行死活判断。本发明具有快速、准确、灵敏、重复性好等特点，有望替代传统的孢子萌发方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

图1为本发明一种实施例的北美大豆猝死综合症病菌单个孢子活性检测图，图中A和B为活孢子的扫描结果图，A为激光扫描通道下的扫描结果，B为明场通道下的扫描结果，C和D为死孢子的扫描结果图，C为激光扫描通道下的扫描结果，D为明场通道下的扫描结果；

图2为本发明另一种实验例中北美大豆猝死综合症病菌2个孢子活性检测中染色条件筛选结果图，图中A和B为活孢子的扫描结果图，A为激光扫描通道下的扫描结果，B为明场通道下的扫描结果，C和D为死孢子的扫描结果图，C为激光扫描通道下的扫描结果，D为明场通道下的扫描结果。

具体实施方式

本发明公开了一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法，包括如下步骤：

(1)孢子悬浮液配制；用灭菌去离子水配置北美大豆猝死综合症病菌孢子悬浮液，收集于1.5mL离心管中，振荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清收集孢子；再加入1mL灭菌去离子水洗涤孢子，10000rpm离心1min，弃上清，最后加入1mL灭菌去离子水重悬，获得孢子悬浮液，浓度约为10⁵-10⁶个/mL。