[发明专利]人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白、构建方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域靶向成像和给药的制备技术，具体地说涉及人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白、制备方法及其用途。

技术背景

纳米材料因其具有独特的性质使其在癌症诊断分析中展示了许多优势。将纳米技术与生物医学领域相结合(纳米生物医学)已成为纳米技术领域中发展最为迅速的研究领域之一。生物笼状蛋白材料(Protein cages)，如病毒外壳蛋白、热激蛋白70和铁蛋白等，因为本身就是天然生物大分子，因而具有良好的生物兼容性。它们通常是由多个多肽亚基结合而形成中空的结构，外部直径与中间空穴直径均在纳米尺度范围内。近来随着基因工程、蛋白化学修饰技术与纳米技术的融合，这类生物纳米材料在蛋白的表面、内部以及各蛋白亚基界面易于修饰的特性决定了它们能有效地组装各种功能分子以构建多功能纳米器件，因此引起了的普遍关注和兴趣。因为人们可以根据需要赋予这类生物纳米材料各种各样新的功能。本发明以铁蛋白重链亚基为载体构建功能化铁蛋白纳米粒子，涉及采用原核表达PET系统制备包涵体铁蛋白重链亚基融合蛋白，并获得的人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白(EGF::FTH1)。表皮生长因子受体(以下简称：EGFR)信号转导通路中在细胞的增殖分化过程中起着很重要的作用。大量的研究表明，肿瘤细胞中的EGFR表达量过高。这使得EGFR成为治疗肿瘤或者是肿瘤成像非常好的一个靶点。EGF是EGFR有效的一个配体，将EGF修饰于纳米粒子表面用于肿瘤成像和治疗已见报道，但是将EGF融合于铁蛋白的N端制备蛋白类的纳米粒子，使得该纳米粒子具有肿瘤细胞靶向性的研究尚未见报道。将EGF融合于铁蛋白的C端会使得EGF存在于铁蛋白的内部，因而会丧失对肿瘤细胞的靶向性，不属于本发明的讨论范畴。

此外，本发明所采用的方法包括以Ecoil.BL21(DE3)为表达菌株构建EGF::FTH1工程菌，表达不可溶包涵体、包涵体分离与纯化、包涵体的变复性制备活性融合蛋白等步骤。通过本发明制备的新的融合蛋白可以应用于表皮生长因子受体表达过量的肿瘤，如乳腺癌的早期诊断和药物的传输系统。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的可用于肿瘤早期诊断和药物传输系统的载体蛋白——人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白。

本发明的目的还在于提供一种构建人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白的方法。

本发明的另一目的在于提供一种上述人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白的用途。

本发明所述的人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白其融合方式为hEGF融合于FTH1的N端，具有序列如下：

MAMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGYIGERCQYRDLKWWELREFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES。

为实现以上技术目的，本发明采用基于PET原核表达制备活性蛋白的方法，包括以下过程：

构建pET28a(+)/hEGF::FTH1表达工程菌

采用重叠PCR技术扩增hEGF::FTH1的基因，并将片段插于pET28a(+)载体上。片段和载体连接后，转化入DH5α感受态细胞内以筛选正确序列的表达载体。之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.BL21(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌。

诱导pET28a(+)/hEGF::FTH1表达菌表达hEGF::FTH1目标蛋白

将表达工程菌接种于新的LB培养液中，加入IPTG过夜培养。次日离心洗涤，收集菌体。上述的表达工程菌以1∶100比例接种于新的LB培养液中。

分离与纯化包涵体

破碎菌体，离心后回收沉淀。以含有1％tritonX-100溶液洗涤沉淀。

变复性制备活性hEGF::FTH1目标蛋白

以8M尿素溶液溶解以上步骤获得的包涵体。之后梯度透析复性制备hEGF::FTH1目标蛋白。