[发明专利]诱导海带幼苗体细胞产生二倍雌雄配子体的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种海带雌雄配子体的生产方法，尤其是一种诱导海带幼苗体细胞产生二倍雌雄配子体的方法。

背景技术：

海带(Laminaria japonica)属于褐藻门、褐子纲、海带目、海带科、海带属，属于经济价值较高的大型冷水性藻类，在亚洲主要分布在日本列岛、朝鲜半岛和我国的高纬度海区沿海，在我国主要分布在辽宁和山东两省。海带味道鲜美，营养丰富，含有包括全部人体必需氨基酸的19种氨基酸，蛋白质、膳食纤维、糖份、维生素和矿物质含量较高，特别是膳食纤维和碘含量较高，是深受消费者欢迎的健康食品，同时还是生产褐藻胶的原料，为此海带已是我国进行大规模栽培的主要藻类之一。

目前，在我国北方沿海浮筏栽培海带使用的苗种为夏苗，每年10月上旬藻体长度为1cm左右的幼苗出库，经过1个月海区暂养，当幼苗长度达到10cm左右后分苗进入栽培阶段，至第二年的5月中旬藻体长度达到3～4m。随后，藻体叶片表面形成孢子囊斑，在7月初孢子囊成熟放散出游孢子进入繁殖期，孢子放散后藻体溃烂流失死亡。由于海带叶片表面形成孢子囊斑后产品价值降低，生产单位被迫将收获期提前，海带生长周期短，商品海带个体小、产量低。

发明内容：

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种诱导海带幼苗体细胞产生二倍雌雄配子体的方法。

本发明的技术解决方案是：一种诱导海带幼苗体细胞产生二倍雌雄配子体的方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.将长度4～6mm的无菌海带幼苗铺在灭菌的载玻片上自柄部将假根切下，再将幼苗叶片移到烧瓶中并添加培养液，将烧瓶静置于温度20℃、照度2000Lx条件下培养，光照时间为12小时/日，培养液每10天全量交换1次，培养2～3个月；

b.将长成的丝状体藻团从叶片上剥下，按照粗大细胞丝状体藻团及细长细胞丝状体藻团在载玻片上切碎后分别置于不同培养皿中，添加培养液后置于温度10～20℃、照度2000Lx、光照12小时/日的条件下分别增殖培养，培养至雌、雄配子体长满培养皿底面，用毛刷将配子体刷下，分别移到烧瓶内添加培养液后保存。

本发明是以海带幼苗为材料，采用切除假根的方法诱导其体细胞产生配子体，由于幼苗是二倍体，所产生的雌雄配子体为二倍雌配子体和二倍雄配子体。因所产生的配子体与其来源藻体具有相同遗传性状，可与不同品种海带的正常单倍雌雄配子体杂交获得大量的海带三倍体幼苗，自交则可产生海带四倍体幼苗，其倍化率可达100％，经海区暂养和分苗后在浮筏上栽培为海带多倍体成体。多倍体海带将用于发育的能量转化为生长，生长速度快，可大幅度延长生长周期，商品海带个体大、产量高、质量好。

具体实施方式：

a.在海带的繁殖期内，取浮筏栽培成熟种藻生有孢子囊斑的叶片，经阴干刺激后放入添加消毒海水的烧杯内，当观察到有大量孢子放散孢子水呈浅褐色时捞出叶片，用吸管取少量孢子水移到有培养液的培养皿内，2小时后，可见培养皿底面有圆形的胚孢子附着，将培养皿移到温度10℃、照度2000Lx条件下培养，培养液每天全量交换1次；培养2天后，附着在培养皿内的裙带菜胚孢子萌发形成雌雄配子体，培养半个月后，可见雌配子体形成卵囊并排出卵；雄配子体形成精子囊并放出精子，卵受精后经细胞横分裂成为2个细胞的幼孢子体；在温度10℃、照度2000Lx条件下幼孢子体进行旺盛的的细胞纵横分裂，藻体长度快速增加，培养20天后达到1mm以上，已肉眼可见，培养40天后藻体长度已达到4～6mm以上，成为无菌海带幼苗；亦可将外购的海带幼苗经消毒海水漂洗、浸泡为无菌海带幼苗。将长度4～6mm的无菌海带幼苗铺在灭菌的载玻片上自柄部将假根切下，再将幼苗叶片移到烧瓶中并添加培养液，将烧瓶静置于温度20℃、照度2000Lx条件下培养，光照时间为12小时/日，培养液每10天全量交换1次。切去假根的叶片失去极性，脱离藻体束缚的体细胞向多方向分裂使叶片失去原来的形态呈多角形。切去假根15天后观察，可见叶片部分细胞体积增大呈圆形，细胞内色素体增大呈褐色。培养20天后，可见圆形细胞长生突起并向外延伸，经细胞分裂后形成单列细胞的丝状体。培养2～3个月，丝状体藻团已长成2～5mm。

所述培养液为向1L加热至80℃经过滤后的自然海水中添加NaNO₃100mg、NaH₂PO₄·12H₂O 20mg及PI溶液1ml。

PI溶液公开于西澤一俊，千原光雄。藻类研究法[M]東京：共立出版株式会社，1979：281～293.