[发明专利]珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种珍珠蚌褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶基因工程菌的构建及酶产物生产和纯化工艺，属于生物酶制备技术领域。

背景技术

随着现代生物科学的发展，科学家终于揭开了影响人类健康长寿之迷，自由基是导致人类各种疾病的原凶。同时也发现了清除体内自由基的酶一超氧化物歧化酶SOD。SOD是国际医学界公认的能清除体内自由基的活性酶。

超氧化物歧化酶(SOD)具有专一清除生物体内的超氧离子，平衡机体的氧自由基，保护人体细胞免受环境因素破坏，现代医学研究表明SOD酶抗衰老、抗辐射、抗疲劳、消炎，抑制肿瘤和癌细胞，提高机体免疫力，能有效降低血脂、胆固醇和血压，起到增强肝肾的功能，预防前列腺炎，调节女性生理周期，推迟更年期。SOD酶对糖尿病也有明显的恢复作用。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。

但目前商品化的SOD酶由于热稳定性差，非常容易失活，极大的影响其功能的正常发挥，市场需求受到极大制约。目前市场流通的SOD，大多是从动物血液中提取的，用于人类难以消除各种病毒及外源污染，并且欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD用于人类。目前日本、加拿大等国家也开始采用基因重组等新的生物工程技术来合成SOD。因此利用生物工程生产新一代高稳定性，高耐热性的SOD酶是当前SOD酶开发最重要的途径。中国专利(CN1263158“重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、产物制备方法”公开了一种重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌产物制备方法。其基因来自丝状兰藻-鱼腥藻的总DNA，克隆到pET32载体上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得工程菌。将工程菌高密度培养，用IPTG诱导后，基因得到大量表达。产物经DEAE-SephadexA-50柱层析，纯化产物为一种重组超氧化物歧化酶。

上述发明获得的是来自于鱼腥藻的含有199个氨基酸残基的成熟蛋白的SOD酶，而且在表达过程中没有加入一定浓度的CuSO₄和ZnCl₂，因此酶的比活不是太高，而且表达产物主要以包涵体形式存在，因此要获得有活性的酶产物需要一个比较繁琐的复性过程。。

发明内容：

本发明的目的，是针对现有技术的不足，利用分子克隆和基因重组技术，开发一种来自于褶纹冠蚌的SOD酶产品：通过分子克隆技术获得褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶(Cp-CuZnSOD)基因，经过与国际基因数据库(GeneBank)比对，发现该基因编码的SOD酶氨基酸序列与全球已知SOD酶基因同源性相比，是一个全新的SOD酶基因，编码155个氨基酸的成熟蛋白。利用该基因构建了一种基因工程菌，该工程菌产生的SOD酶活性高，性质稳定，具有很好的应用前景。

本发明的技术方案是：挑选健康的褶纹冠蚌，从蚌组织细胞或血细胞中提取总RNA。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法合成cDNA。以第一链cDNA为模板，用一对表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4 DNA连接酶将Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，用含卡那霉素的LB琼脂平板筛选阳性克隆，将测序验证后的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组表达菌。重组表达菌接种于LB培养基中37℃培养至对数生长期，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导。同时在培养基中同时加入一定浓度的Cu²⁺和Zn²⁺离子，转移至20℃-25℃下继续培养4-8小时，离心收集菌体。将收集的菌体超声波裂解后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L-250mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，然后将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

专利CN1263158与本发明的差异对比表：

                  专利CN1263158                 本发明