[发明专利]猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒属的代表种，它是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可将PCV分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)两个型。PCV1对猪无致病性，为非致病性PCV。PCV2对猪有致病性，可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)，又称PMWS相关PCV。Hamel等通过对PCV基因组分析，发现PCV1和PCV2均可能含有11个开放阅读框(Openreading frame，ORF)。PCV2阅读框中，ORF1和开放阅读框2(ORF2)为主要阅读框。现已证实ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2全长702bp，编码病毒的主要结构蛋白及病毒核衣壳蛋白(Cap)。PCV2在细胞上的增值滴度很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率并不高；而亚单位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力。

现在已经开发了利用昆虫细胞的一个便利和多用途的杆状病毒载体表达系统(Baculovirus Expression Systems)。杆状病毒的特征是通常包含在包涵体(也称为多角体)的杆状病毒颗粒。杆状病毒科可以分为两个亚科：真杆状病毒，有两个包涵体病毒属，即核多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV)；和包括非包涵体病毒的亚科裸杆状病毒。许多蛋白质已经在编码该蛋白质的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。杆状病毒表达系统提供了生产重组蛋白质的有力工具。昆虫细胞的无血清培养技术已经十分成熟，昆虫细胞的微载体培养技术和悬浮培养技术为大规模制备重组蛋白提供了条件。我国每年因猪圆环病毒2型的爆发给我国养猪业带来了巨大的经济损失，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗，对于猪圆环病毒相关病毒的防制具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1).克隆猪圆环病毒2型ORF2基因并引入信号肽基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的转移载体；

(2).包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；

(3).重组杆状病毒感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养；

(4).由重组杆状病毒的猪圆环病毒2型重组ORF2基因表达猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，收获和纯化猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白；

(5).利用猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，辅以佐剂，经乳化，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

优选地，本发明步骤(1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列包含序列表中的SEQ ID NO1。

优选地，本发明步骤(1)中信号肽基因序列包括蜂毒素信号肽核苷酸序列。

优选地，本发明所述的蜂毒素信号肽核苷酸序列包含序列表中的SEQ ID NO2。

优选地，本发明步骤(2)中所述重组猪圆环病毒2型ORF2基因的表达受多角体启动子的控制。

优选地，本发明步骤(4)中所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列包含序列表中的SEQ ID NO3。

优选地，本发明所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白是下面任意一种多肽：

i)选自序列表中SEQ ID NO3序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

优选地，本发明步骤(5)中所述的佐剂为水性佐剂或油性佐剂。

本发明的另一个方面为使用本发明方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

本发明的另一个方面为使用本发明方法制备的猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

优选地，本发明所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗包含至少1微克/头份的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白。

发明效果