[发明专利]一种不需选择标记基因的洁净DNA转化植物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因枪介导外源基因表达框(启动子-基因编码区-终止子)转化植物的方法，此方法不需使用任何选择标记基因，获得的转基因植株除目的基因外不含任何多余垃圾DNA，是一种洁净DNA转化技术(Clean DNA transformation)。属于生物学领域，特别涉及到基因工程技术。

背景技术

自1983年第一例转基因植物诞生以来，植物基因导入技术日臻完善，形成了以基因枪和农杆菌两大转化技术为主体的植物基因转化系统。包括大豆、玉米、油菜、棉花、马铃薯、水稻等主要农作物在内的数十种转基因植物已在多个国家进入大田试验甚至商品化种植。与此同时，转基因植物潜在的生态环境危害以及由之而来的遗传修饰食品对人类的食用安全性，已成为转基因农作物推广应用的重要障碍。引发转基因植物安全性问题的根源有两个：(1)转基因植物中的抗性选择标记基因。在植物转化过程中，由于目前的基因导入技术只能将外源基因导入少数细胞中，所以普遍采用选择标记基因来区分转化和非转化细胞，在导入目的基因的同时必须引入选择标记基因才能实现对植物细胞的有效转化。其中赋予转化细胞对除草剂或抗生素抗性的抗性选择标记基因(resistant selected marker gene)是植物转化中普遍使用也是最有效的选择标记基因，对植物细胞转化处理后，通过在培养基中加入相应的除草剂或抗生素对细胞进行筛选来获得转化细胞。转基因植株再生后，这些抗性选择标记基因通常不再具有应用价值，但除草剂抗性基因可能通过基因漂移传递给近缘物种，产生恶性杂草，对生态环境造成危害；抗生素抗性基因可能通过基因漂移转移给土壤微生物或通过食物链转移至人类肠道微生物，使人对相应抗生素产生抗性，影响人类健康。因此抗性选择标记基因是引发转基因植物安全性问题的重要原因，已成为转基因植物商品化应用的严重障碍。(2)转化质粒载体框架DNA序列。由于植物遗传转化时普遍使用完整质粒，质粒载体框架序列通常随着外源基因一起整合到受体基因组中。已有大量研究证据表明，在农杆菌介导转化的转基因植株和基因枪法等直接转化系统介导转化的转基因植株中载体框架序列的整合现象普遍存在。质粒载体框架序列不可避免地含有允许基因构建体在大肠杆菌中或农杆菌中克隆的抗生素抗性选择标记和复制起点，具有向外界环境中逃逸的潜在危险性(Fu Xiangdong，et al.Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns.Transgenic Research，2000，9：11-19)。

基因枪法可将去除质粒载体框架序列的外源基因表达框(仅包括启动子、基因开放阅读框、终止子)导入植物基因组，从根本上消除质粒载体框架序列的不利影响，实现洁净DNA转化(clean DNA transformation)，目前国内外已有少数研究者利用洁净DNA转化技术获得了水稻、马铃薯、葡萄藤、小麦、玉米等转基因植株(Altpeter F et al.Particle bombardment and the genetic enhancement of crops：myths and realities.Mol.Breeding.2005，15：305-327)，并研究采用共转化法获得无选择标记的转基因植株(ZhaoY，et al.Co-transformation of gene expression cassettes via particle bombardment to generate safe transgenic plant without any unwanted DNA.In Vitro Cellular andDevelopmental Biology-Plant，2007，43(4)：328-334；Shiva Prakash N et al.Marker-free transgenic corn plant production trough co-bombardment.Plant Cell Reports，2009，28：1665-1668)，但这些洁净DNA转化体系中均使用了抗性选择标记基因，转化过程要经过转化细胞的筛选和抗性标记基因的剔除才能获得无抗性标记基因的转基因植株，程序非常繁琐，获得抗性标记基因的转基因植株的频率也很低。