[发明专利]全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TNFa抗体的Fab片段及其PEG化抗体。

背景技术

自身免疫性疾病发病率高，全世界约有3.55亿人患有各种自身免疫性疾病，1999年世界卫生组织将风湿病与癌症和心血管疾病列为威胁人类健康的三大杀手。风湿病发病率高，致残率高，在我国，由风湿病导致的致残人群逾千万。这其中，以类风湿性关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)危害性最大，未经治疗的RA和AS的致残率分别高达70％和30％。

目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，不是利用类固醇(steroids)来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应(inflammation)外，就是使用免疫抑制药物(immuno-suppressant drugs)，抑制免疫系统的作用。不过，这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。在生物制剂抗TNF抗体问世之前，风湿病并无特效药物治疗，非甾体类抗炎止痛药及改善症状的免疫抑制剂只能改善病人的症状，改善生活质量，不能完全缓解病情。仅此类的药物的用量在我国每年都已超过200亿。因此，风湿病严重的影响了患者的身心健康，并且给患者带来了沉重的经济负担，同时也影响了社会的发展。

目前的研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是RA和AS病变过程中起主要作用的细胞因子，实验和临床结果均证实TNF-α是治疗该病的适合靶点。据此，TNF-α的拮抗剂相继诞生了，包括Amgen公司的Enbrel(etanercept)，Centocor公司的Remicade (infliximab)，Abbott的Humira(adalimumab)。Enbre是人TNF-α受体和Fc的融合蛋白。Remicade是一种人-鼠嵌合的抗人TNF-α单克隆抗体，可特异性结合可溶性及膜结合型TNF-α。2002年12月Abbott公司的Humira成为第一个抗TNF-α的全人单克隆抗体，使单克隆抗体药物的研究开发进入了一个新的时代。由于是全人抗体，避免了Remicade会产生免疫反应的缺点。针对TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的RA治疗药物。

完整的单克隆抗体分子量大，且Fc段可补充细胞毒效应分子功能，并可延长在血清中的半衰期。但是完整的单克隆抗体由于它具有一下的缺陷，使得他的应用受限：1、用量大，制备工艺复杂，目前国际上也只有少数生物企业掌握了大规模表达单克隆抗体的技术；2、Fc片段分子量大，不易穿透细胞；3、价格昂贵；4、有时Fc诱导的细胞因子失活、受体封闭或病毒中和等作用不希望出现。近年来，国内外研究证明在一定条件下，Fab片段可以取代完整的单克隆抗体发挥作用。Fab片段具有以下优势：1、可以在大肠杆菌大规模表达。中国是发酵大国，可以充分利用这种优势大力发展抗体技术；2、由于去除了Fc片段，在药代动力学上表现了更好的组织穿透能力；3、内效应子缺乏。同时因为去除了Fc片段，Fab片段具备了这些缺陷，包括：1、由于在大肠杆菌表达，增加了Fab片段的抗原性；2、由于去除了Fc片段，在体内代谢加快，半衰期减短。

PEG修饰技术的出现可以很好的改善Fab片段的上述缺陷。比利时UCB制药公司和Nektar公司合作开发将聚乙二醇与人源化抗TNF-α小型抗体Fab(肿瘤坏死因子)结合，实验证明二者结合后仍能保持与TNF-α的结合活性，并且显著延长半衰期，减少给药次数。聚乙二醇化抗TNF-α小型抗体Fab(CDD-870，Cimzia)在2008年获得FDA批准用于治疗类风湿性关节炎。1977年，Abuchowski利用与聚乙二醇(PEG)共价结合来改变BSA(牛血清白蛋白)的免疫原性，开启了现代聚乙二醇化技术。经过30多年的研究发展，PEG化修饰已经成为现代医药领域成熟的“黄金标准”技术，广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物的修饰。PEG可将干扰素之类的蛋白质药物分子包裹起来形成凝胶剂，因其分子量变大，不易通过肾脏排泄，故能大大延长蛋白质类药物在体内的作用时间。蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素。超氧化物歧化酶目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种.蛋白质多肽类经聚乙二醇修饰后具有以下优点：1、溶解度和稳定性增加；2、免疫原性和抗原性减少，毒副作用降低；3、血浆半衰期延长和体内系统暴露增加；4、体内生物活性和疗效增加。