[发明专利]特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及三对特异性体外干扰人T细胞中LAT(Linkerfor activation of T cell)蛋白表达的SiRNA，另外本发明还涉及此SiRNA的用途。

背景技术

T细胞活化衔接蛋白(Linker for the activation of T cells，LAT)是一个分子量大约为36-38kDa，并在TCR发生交联后被迅速磷酸化的蛋白。LAT属于完整的跨膜衔接蛋白，并通过近膜的两个棕榈酰化序列定位于T细胞上富含糖脂的脂筏区域，是T细胞信号转导中ZAP-70的主要作用底物之一，并可招募和活化许多下游信号分子诸如Gads，Grb2以及PLC-γ1等，参与TCR介导的信号转导，并在T细胞发育和活化过程中起重要作用。

LAT在T细胞信号转导中发挥重要作用的分子机制在于被磷酸化的LAT分子可以招募和结合与T细胞活化信号相关的多个含有SH2基序的胞浆分子，如Gads，Grb2以及PLC-γ1等，这些游离于胞浆中的分子一旦和LAT分子结合后，一方面在空间上可以形成区域化的复合物，同时这些在空间上相互靠近的分子可以进一步相互作用，或者是被磷酸化，或者可以结合更多的分子，如和LAT结合的PLC-γ1在结合的同时也被进一步激活，水解胞内PIP2(磷脂酰肌醇二磷酸)产生两种第二信使即DAG和IP3。IP3引发钙离子内流提高胞内的钙离子量，这条通路最终激活转录因子NF-AT，并进而进入细胞核内；DAG则通过Ras-MAPK途径和PKC途径分别激活转录因子AP-1和NF-κB，促使其进入细胞核内后，上述三个转录因子通过和IL-2基因的启动子区结合最终导致IL-2的分泌；和磷酸化的LAT分子结合的另一个重要的分子则是胞浆中的衔接蛋白Gads，通过Gads可以将TCR信号转导中的另一个关键蛋白SLP-76招募至TCR分子附近，最终介导细胞骨架重组和黏附分子表达的改变等，从而导致T细胞的完全活化。由此可见LAT在T细胞信号转导中的重要性在于作为TCR受到外界抗原信号后发生系列酶学催化反应的早期阶段，LAT分子作为参与的膜分子起着承上启下的作用，并最终将TCR在胞外接受到的刺激信号转化为胞浆内的各个信号转导通路，并进而导致T细胞的活化和分化。尽管目前对TCR受到的抗原信号是如何决定T细胞活化和分化的命运的分子机制还不甚了解，但是可以推断无论是何种结局，LAT分子在其中发挥着关键作用。

LAT在T细胞信号转导中的关键作用在体外细胞系统和小鼠体内系统中都得到印证：LAT分子基因敲除的小鼠外周表达CD3，CD4，CD8的αβT或γδT细胞均缺失，分析胸腺中胸腺细胞的发育，发现胸腺细胞的发育被阻滞在CD4^-CD8^-阶段，大多数的胸腺细胞被阻滞在CD25⁺CD44^-的DN3阶段(在T细胞分化为CD4⁺CD8⁺之前经历了CD25^-CD44⁺-CD25⁺CD44⁺-CD25⁺CD44^--CD25^-CD44^-四个阶段)，而DN3阶段正是由LAT参与的preTCR介导的信号对胸腺细胞的发育和选择起关键作用的阶段，而LAT分子的缺失导致preTCR信号的缺失，从而导致胸腺细胞的发育受阻；而在T细胞系细胞株中LAT分子的缺失则直接导致TCR对外界刺激的无应答。

鉴于LAT在TCR信号转导中的关键作用，而在自身免疫病或是移植排斥中T细胞应答存在异常增高，如果能够特异性减低或是减少这些病理状态下T细胞中LAT分子的表达，则有望可以降低病理状态下的免疫应答，从而达到缓解疾病的目的。

为此，通过建立体外干扰LAT分子表达的方法(如SiRNA)，为进一步研究LAT在T细胞信号通路中的分子机制和临床应用前景提供了有效的新手段。

siRNA干扰：

RNA干扰(RNAi)的基本原理是利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)迅速阻断序列特异的目标基因的表达活性，是实验室中是一种有效的阻断基因表达的工具。

siRNA有如下特点：

1.SiRNA长度一般在22nt左右，结构上属于双链RNA。

2.SiRNA一般是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干扰的中间产物。