[发明专利]一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

肝病是常见的临床疾病，仅乙肝、丙肝等病毒性肝炎患者在世界各国人数接近5亿，占全球人口的1/12，中国是慢性乙型肝炎高发地区，每年约有35万人死于乙肝相关疾病，如肝硬化、肝癌、重型肝炎等，1％的乙型肝炎患者发生重型肝炎。重型肝炎是机体在多种致病因子作用下，肝脏在短期内的大量坏死所致的肝功能衰竭的一类综合症，其临床表现特点为病情重、发展快、并发症多、病死率高，迄今仍是肝病领域中亟待解决的难题。 

目前，临床上检测肝细胞损害最直接的方法就是肝细胞穿刺，但由于其有创性，且可能造成一定风险，尚不能被广泛接受，而体液中可靠的肝细胞坏死标志尚未完全探索清楚，有很多血液生化指标可以间接的对肝脏损害进行评价，如转氨酶、胆红素、白蛋白、胆碱酯酶、凝血酶原活动度等等，但这些实验室指标都各自存在着一些缺点，如胆红素及凝血指标，都是在肝细胞很大程度上死亡，剩余肝细胞不能 代偿时才有变化，且半衰期较长，如白蛋白半衰期达15-19天，不能及时反应肝脏损伤状态；胆红素由于直接胆红素和间接胆红素在体内代谢的特点，在临床上，梗阻性黄疸和肝细胞性黄疸有时难以鉴别；转氨酶、胆碱酯酶等的变化在重型肝炎中肝损害的检测中也只有辅助作用。因此，在重型肝炎诊断标准方面一直存在着一些争议，有学者按现行的2000年西安会议修订的慢性乙型重型肝炎病理学诊断标准确立118例患者，其中17.8％不符合临床诊断标准，其中少数病例在组织学上已呈现肝细胞大块、亚大块坏死，PTA仍高达60％；总胆红素有11例未达到诊断标准，但病理已证实为重型肝炎。所以，探索新的肝坏死标志物、及时有效的预测重型肝炎的发生及发展显得极为重要。 

目前在循环核酸的研究中，循环核小体浓度的研究作为一种预测疾病进展以及预测疾病发生的重要作用已经公认，它作为机体的一种代谢产物，来源与细胞凋亡与坏死、血细胞代谢以及淋巴细胞和肿瘤细胞的分泌，与机体的状态、自身免疫性疾病、感染、创伤、移植、肿瘤、产科疾患都有着关联，目前在定量实验中虽然存在着一些方法学上争论，但各种定量技术已经非常成熟。而且，在实验前准备、使用血清或者血浆等方面已经达成一定的共识。而且在肝炎研究方面中，国外已有学者研究了急慢性肝衰竭的核小体变化并比较了MARS前后的变化，发现了急性肝衰竭患者血浆核小体明显的升高。国内有学者在检测了重型肝炎患者的血浆核小体水平，认为其比急性肝炎、慢性肝炎及肝硬化升高中，并将其与ALT进行了相关性比较，其他方面的研究尚未见文献报道，重型肝炎中核小体的定量测定是可行的。 

发明内容

本发明的目的是提供一种血浆游离DNA分离提取方法以及定量，以游离DNA水平反映肝细胞坏死程度。 

为了达到本发明的目的，本发明是这样实现的： 

本发明提供了一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，包括引物β-globin标准品制备，肝病患者血浆标本血浆DNA的提取，对血浆标本中提取的血浆DNA进行实时荧光定量聚合酶链反应，血浆游离DNA的浓度测算，其特征在于，所述β-globin标准品为引物合成，上、下游引物分别为： 

上游引物globin-F：ACACAACTGTGTTCACTAGC 

下游引物globin-R：CAACTTCATCCACGTTCACC。 

所述的引物β-globin标准品制备方法如下：反应总体积25μl的β-globin引物进行PCR扩增，扩增条件为预变性95℃1min，然后95℃30s，57℃20s，72℃20s，共45个循环；凝胶回收纯化PCR产物；制备DH5a超级感受态细胞；目的基因连接转化及转化后测序验证；提取质粒，并进行定量；所述β-globin重组质粒长度为2802bp，浓度为2.58×10¹³copies/ml，10倍梯度稀释后即为所须标准品。