[发明专利]间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和免疫学技术领域，更具体地，涉及单克隆抗体和多克隆抗体技术领域，特别是指一种间日疟原虫乳酸脱氢酶(Pv-LDH)抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用。

背景技术

疟疾(malaria)是由疟原虫感染引起的危害严重的寄生虫病。感染人类的疟原虫有四种：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，P.f)、间日疟原虫(P.vivax，P.v)、三日疟原虫(P.malariae，P.m)和卵形疟原虫(P.ovale，P.o)。据WHO统计，全球107个国家和地区有疟疾的流行和传播，32亿人受疟疾威胁。每年有3～5亿人发病，死亡人数达100多万。

快速和准确地诊断是有效开展疟疾防治的关键，也是全球疟疾控制策略的主要干预措施之一。但是，目前最广泛应用的临床诊断法是基于疟疾的临床症状进行诊断，由于疟疾症状特异性不强并不可靠；显微镜检查具有敏感性高、获得信息量多(可确定虫种、虫期、形态变化和定量)、费用低、血片可永久保存便于质量控制等优点被认为是目前疟原虫感染检查和鉴定的“金标准”，但镜检耗时费力，其准确性很大程度上取决于镜检设备、血片制作和镜检人员的技术和经验。不幸的是，这些条件在现场或基层的卫生机构中通常得不到满足，导致镜检结果不可信。

近年来，疟疾的快速诊断方法有了长足的发展，应用免疫层析方法检测指尖血滴中疟原虫特异性抗原的试验可在15分钟内完成，且操作人员仅需短时间的培训，无需电力和特殊的仪器设备。快速诊断试验在缺乏镜检条件的边远地区和紧急情况下，无疑是对镜检诊断方法的重要补充。

然而，国内外目前已开发的商品化检测试剂盒都只能检测恶性疟原虫和非恶性疟原虫感染，对于以间日疟感染为主的我国大部分流行区，尚缺乏种特异性。因此，急需提供间日疟感染的种特异性检测，弥补目前尚无间日疟特异性检测方法之不足。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用。间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体能特异性检测间日疟原虫乳酸脱氢酶，可用于间日疟感染的特异性检测。特异性高，反应灵敏，成本低，适于高通量检测。

为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特点是，所述间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体是对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中所述“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。因此，上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体能够特异性识别和结合SEQ ID NO：2所示的蛋白。SEQ ID NO：2所示的蛋白可以直接合成，也可以通过基因工程方法制备。在本发明的一具体实施例中，SEQ ID NO：2所示的蛋白可以是由SEQ ID NO：1第1至951位核苷酸编码产生。

制备本发明的单克隆抗体所用的抗原是通过基因工程的方法获得，利用在原核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列SEQ ID NO：1。本领域的技术人员通常熟知适用于表达本发明的抗原的载体。可根据所选用的适当启动子和待表达的目的基因序列来选择适当的载体。可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。适当宿主的例子包括：原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以是化学物质或环境刺激。在本发明的一个优选具体实施例中，采用的诱导物为IPTG(异丙基β-D硫代半乳糖苷)。

在本发明的一具体实施例中，应用特异引物进行PCR扩增以及质粒水平上的核苷酸序列重组得到了Pv-LDH基因读码框的全长序列；并通过EcoRI和XhoI酶切、连接等步骤将包含Pv-LDH基因全部开放读码框的951bp核苷酸序列克隆到原核表达载体pET28a中，构建成原核表达质粒，转化大肠杆菌，在IPTG的诱导下，表达为分子量约Mr41000的融合蛋白rePv-LDH。