[发明专利]一种同步检测多种烟草病毒的方法

权利要求书

1.一种同步检测2-5种烟草病毒的方法，该方法包括烟草病毒总RNA的提取，多重RT-PCR和电泳检测确定病毒种类，其中烟草病毒选自烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2-5种，其中多重RT-PCR反应中应用的引物为包含如下5对引物中的2-5对引物的引物组：

第1对引物：

SEQ ID NO.1：5′-TAGACCCGCTAGTCACAG-3′

SEQ ID NO.2：5′-CAGAGGTCCAAACCAAAC-3′

第2对引物：

SEQ ID NO.3：5′-GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3′

SEQ ID NO.4：5′-GTGGGAATGCGTTGGT-3′

第3对引物：

SEQ ID NO.5：5′-TGATGGATGGTGAGGAG-3′

SEQ ID NO.6：5′-GTGCCGTTCAGTGTCTT-3′

第4对引物：

SEQ ID NO.7：5′-CCGAGAATCAAGGCTATC-3′

SEQ ID NO.8：5′-CGCTAAACCTACATCCC-3′

第5对引物：

SEQ ID NO.9：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′

SEQ ID NO.10：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′。

2.根据权利要求1所述的方法，其中引物组中包含5对引物SEQ IDNO.1-10。

3.根据权利要求1所述的方法，该方法包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取感染2-5种病毒的烟草叶中的病毒总RNA；

2)多重RT-PCR：

应用SEQ ID NO.2、4、6、8、10(第1-5对引物中反向引物序列)对病毒总RNA进行逆转录制备cDNA模板，然后应用SEQ ID NO.1-10(第1-5对引物中的正向和反向序列)对cDNA模板进行多重PCR反应，得扩增产物；

3)电泳检测：

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定烟草病毒种类。

4.根据权利要求3所述的方法，其中多重PCR反应中五对引物浓度比例为第1对引物∶第2对引物∶第3对引物∶第4对引物∶第5对引物＝1.2-1.6∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶1.3-1.7。

5.根据权利要求4所述的方法，其中多重PCR反应中五对引物浓度比例为第1对引物∶第2对引物∶第3对引物∶第4对引物∶第5对引物＝1.4∶1∶1∶1∶1.5。

6.根据权利要求3所述的方法，其中多重PCR反应中dNTPs浓度为0.12-0.32mmol/L；Taq DNA聚合酶浓度为0.02-0.12U/μL；Mg²⁺浓度为1.2-3.2mmol/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其中多重PCR反应中dNTPs浓度为0.28mmol/L，Taq DNA聚合酶浓度为0.10U/μL，MG²⁺浓度为2.4mmol/L。

8.根据权利要求3所述的方法，其中多重PCR反应中，退火温度为48-51℃，延伸时间为60s-90s，循环次数为3045次。

9.根据权利要求8所述的方法，其中多重PCR反应中，扩增条件为退火温度51℃，延伸时间60s，循环次数35次。

10.根据权利要求3所述的方法，其中病毒总RNA的提取过程中，采用BIOzol试剂盒提取总RNA。