[发明专利]一种在真菌中表达鉴定外源基因的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种植物转基因育种方法，具体涉及一种利用CaMV 35S启动子在真菌中表达外源基因，快速鉴定基因功能的方法。

背景技术：

在现有技术的植物转基因育种方法中，待转入的外源基因通常需要首先在真核生物中进行表达和功能验证，再导入目标植物中。目前常用的方法是：通过转化模式植物，如烟草或拟南芥，检测其表达情况及初步功能，再将该基因转到目标植物中。这个过程鉴定周期较长，一般需要6-8个月才能完成，并且费时、费力。

真菌是最简单的真核生物。与转化植物相比，真菌的遗传转化省去了播种、收获、组织培养等繁琐的操作过程，并且周期短，操作简便易行。因此，如果能够在真菌中实现外源基因的表达和功能初步鉴定，将大大缩短转基因育种进程。用作真菌转化的方法很多，但目前公认的方法是通过农杆菌介导(侵染)的转化。实现转化过程已经是成熟的技术，通过农杆菌转化真菌和转化植物的原理基本相同。

目前，用于高等植物遗传转化的表达载体，其标记基因和功能基因所使用的启动子均为CaMV35S启动子。CaMV35S是来自花椰菜病毒的一种强启动子，可以被植物识别，被广泛应用于植物转基因育种中。但是，遗憾的是，多数真菌对其无法识别，如果将植物表达载体转入真菌，则会导致其所带有的抗性标记基因和功能基因无法在真菌中表达。所以，当科学家从原核生物(如细菌)中获得一个有用的基因后，必需先在拟南芥这样的模式植物中去做初步表达和功能鉴定，然后再转入需要的植物中，因为拟南芥的遗传转化非常容易、方便(植物转化比较难，主要难在组织培养成苗过程)，然而，就是这个目前被认为最方便快捷的过程也需要半年以上。因此，在真核生物中建立一个更加快速、简便易行的外源基因表达鉴定方法很有必要。

有人发现，尖孢镰刀菌可以识别CaMV35S启动子，现有技术中，尚未见有人将其用于在真菌中对外源基因的表达和功能鉴定。

发明内容：

本发明的最终目的是建立一种能够快速、省时、省力地在真菌中对来自原核生物的新的功能基因进行表达和功能鉴定的方法。

本发明的直接目的是利用农杆菌介导和CAMV35S启动子表达外源基因和进行功能初步鉴定。

为了解决绝大部分真菌不识别植物表达载体所用的CAMV35S启动子的问题，本发明人对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)可以识别CaMV35S启动子进行了研究。利用了这个特点，本发明实现了在真菌中快速对外源基因进行表达鉴定的目的。

尖孢镰刀菌属于半知菌亚门、镰刀菌属。有人发现，尖孢镰刀菌可以识别CAMV35S启动子。本发明实验证明，常用的植物表达载体pCAMBIA1300可以直接转化尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)获得具有潮霉素抗性的突变体，表明尖刀镰孢菌的确可以识别植物表达载体潮霉素磷酸转移酶基因带有的CaMV35S启动子。这是迄今为止报道的唯一一个可以识别CaMV35S启动子的丝状真菌，这一发现使目前适用于植物转化的双元载体不需要任何修改就可以用来转化真菌。

本发明方法的技术手段是：

利用CaMV35S启动子在真菌中进行基因表达和鉴定的方法，其操作步骤如下：

1、将目的基因克隆至带有CaMV35S启动子的植物表达载体上；

2、将步骤1所得的载体转化导入农杆菌中；

3、用步骤2所得到的农杆菌侵染尖孢镰刀菌，筛选获得阳性转化子；

4、对步骤3所述阳性转化子中含有的目的基因进行表达和初步功能鉴定。

上述步骤1中，所述植物表达载体可以是本领域常用的植物表达载体，如pBI121或pCAMBIA系列等；

步骤3中，可以选用潮霉素抗性为筛选标记。

在运用本方法的一个实例中，发明人构建了高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法，转化尖孢镰刀菌EPSPs基因敲除的突变体，可以使其恢复对草甘膦的耐受性。发明人从原核生物中获得了一个新型高抗草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因，采用本发明提供的方法快速对该基因在真核生物中进行了表达和功能快速鉴定。主要操作步骤如下：

1、将EPSP合酶基因的开放阅读框序列5′端连接CAMV35S启动子，3′端连接nos终止子；

2、将连接好的完整的EPSP合酶基因克隆至pCAMBIA1300的多克隆位点(图1)；

3、得到的重组质粒(表达载体)转化导入农杆菌AGL-1中；