[发明专利]甜菜单体附加系M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种甜菜的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。

背景技术

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitors)是生物体内可以与半胱氨酸蛋白酶特异性结合，并抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一类蛋白质。半胱氨酸蛋白酶抑制剂广泛分布于所有生物体内，目前植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在水稻、小麦、马铃薯等80多个植物物种中得到成功克隆和鉴定。半胱氨酸蛋白酶抑制剂能够抑制鳞翅目、鞘翅目等有害昆虫肠道中执行消化裂解作用的半胱氨酸蛋白酶的活性，进而影响昆虫对氨基酸的消化吸收，最终导致昆虫死亡；植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂还具有抑制植物病原菌生长的作用；另外，植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂还具有增强植物在非生物胁迫下抗逆性的作用。

甜菜单体附加系M₁₄品系是二倍体栽培甜菜和四倍体白花甜菜种间杂交，获得异源三倍体，将其进一步与栽培甜菜回交获得的甜菜无融合生殖单体附加系。甜菜M₁₄品系染色体组除了含有18条栽培甜菜染色体外，还附加有一条白花甜菜第9号染色体，附加染色体的传递率高达96.5％。经过标记基因杂交，多年染色体传递率统计，细胞学、胚胎学及分子生物学鉴定，证实甜菜M₁₄品系具有无融合生殖和抗逆性等优良性状。经专家鉴定，认为甜菜M₁₄品系是发掘野生百花甜菜优质基因资源的良好材料。甜菜单体附加系M₁₄品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及其编码的氨基酸序列的获得为推进甜菜M₁₄品系优良基因资源开发，提高栽培甜菜抗逆性奠定了物质基础。

发明内容

本发明提供了甜菜单体附加系M₁₄品系的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。

本发明首先通过抑制消减杂交技术和比较蛋白组学研究获得甜菜单体附加系M₁₄品系特异表达的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的EST(ExpressedSequence Tag，基因表达序列标签)片段，再通过RACE(Rapid Amplificationof cDNA Ends，cDNA末端快速扩增法)技术获得该基因的cDNA全长序列，然后通过RT-PCR技术验证该基因的存在；并通过BLAST分析获得该基因编码蛋白质的信息。

本发明甜菜单体附加系M₁₄品系的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA序列全长690bp，其有意链中G、A、T、C分别为151个(21.88％)、233个(33.77％)、194个(28.12％)、112个(16.23％)。在该基因全长cDNA序列的135bp处有起始密码子ATG，在447bp处有终止密码子TAG；具有315bp完整的开放读码框，所编码的半胱氨酸蛋白酶抑制剂有104个氨基酸，分子量为11.64kD，等电点为7.91；在N末端附近具有一个保守的G残基，在氨基酸序列内部具有一个高度保守的QVVAG结构域和一个保守的LAKFAVDHHN结构域，其中，LAKFAVDHH结构域是植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂所特有的结构域，在C末端附近具有一个保守的PW结构域。此外，还设计了引物as-433、as-327、s-165、s-311、s-45和as-658。

本发明从甜菜单体附加系M₁₄品系中分离得到的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因所编码的蛋白参与植物在非生物胁迫条件下的应答。半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及半胱氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列的获得为推进甜菜M₁₄品系优良基因资源开发，提高栽培甜菜抗逆性奠定了物质基础。

附图说明

图1是甜菜单体附加系M₁₄品系花器总RNA完整性1％琼脂糖凝胶电泳检测图；图2是以特异性引物s-45和as-658扩增甜菜单体附加系M₁₄品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因全长cDNA 1％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为甜菜单体附加系M₁₄品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因全长cDNA的PCR扩增结果；图3是甜菜单体附加系M₁₄品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守结构域分析图；图4是甜菜单体附加系M₁₄品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在转基因拟南芥基因组DNA中的PCR检测，其中“M”泳道标样为Marker，“1”和“2”泳道标样为未转化植株的阴性对照，“3”～“7”泳道标样为转化植株基因组DNA的PCR检测结果，“8”泳道标样为阳性对照。

具体实施方式