[发明专利]一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种针对甲胎蛋白及其异质体、高尔基蛋白GP73及其异质体的蛋白微阵列检测试剂盒其制备方法和应用。利用该试剂盒可以快速、准确地计算人体外周血中的甲胎蛋白及其异质体、高尔基蛋白GP73及其异质体的表达含量。 

背景技术

肝细胞癌HCC(hepatocellular carcinoma)主要的病因学是HBV或HCV慢性肝病毒感染，在肝癌发生前一般有长时间的潜伏期--即感染肝病毒至肝癌发生时间。据2006年1月26日《中国医药报》报道以及《癌症》2005年第六期中文章的介绍，我国现有乙肝病毒携带者1.2亿左右，约占世界乙肝病毒携带者的1/3；有症状的慢性乙肝患者2000万人，另外我国还有肝硬化患者360万人。由于众多的肝病患者和肝癌高危人群，我国的肝细胞癌发病率最高。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)估计，2000年全世界肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人；我国肝癌发病人数30.6万，死亡30.0万人，约占全世界的50％。 

在高危人群中建立早期诊断和监测机制是非常重要的。早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，高危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。另外要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。 

目前，HCC疾病传统上的监测是体检，肝超声影象分析和血清标志物系列检测。 

其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白AFP，由于甲胎蛋白AFP具有与HCC的相对特异性，因此目前得到广泛应用，但是部分良性肝病中AFP为阳性(特异性≤75％)和部分肝癌中AFP为阴性(灵敏度≤70％)，使得依靠AFP进行HCC预警和监测具有一定的局限性，而且AFP检测对于HCV相关的HCC灵敏度不高。因此在临床上希望获得比甲胎蛋白特异性和灵敏度更高的新血清学指标，或者能够与AFP进行互补的指标。 

凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。 

凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖；麦胚凝集素(WGA)可专一结合唾液酸。 

随着生物化学及其相关分析技术的进展与应用，发现AFP分子与外源性凝集素的亲和力不同，即存在不均一性的糖链异质性。应用不同的凝集素亲和电泳可以把它们分成若干个组分，也可以用等电聚焦技术来分离AFP组分。AFP通过LCA亲和电泳可以分为三个部：AFP-L1(LCA非结合型)、AFP-L2(LCA弱结合型)、AFP-L3(LCA强结合型)。AFP-L1，来自良性肝病，是AFP的主要组分；AFP-L2来自孕妇；AFP-L3为HCC细胞所特有。因此由肝癌细胞合成、分泌的含岩藻糖苷化糖链的AFP异质体称为肝癌特异性AFP(AFP-L3)。 

早在1970年，就有学者发现肝细胞癌患者血清AFP淀粉凝胶电泳时常出现不同的迁移率，而新生儿、胎儿的AFP电泳迁移率相同。当时认为系AFP所含的唾液酸含量不同所致，并提出AFP异质体(AFP Variants AFP-V)的概念。随后的研究表明，AFP的糖链结构存在不同程度的变异，而所谓的异质性主要是因为AFP所含碳水化合物不同所致。AFP异质体形成的确切机制还不十分清楚，其过程可能是这样的：增生的肝细胞及肝癌细胞于G1期和S期合成AFP，并将其分布于核周、内质网腔及高尔基分泌小囊中，位于粗面内质网及高尔基体中的AFP在糖基化转移酶参与下受到不同的糖基化修饰后分泌到循环中。由于糖基化的不同，导致了AFP异质性的差异。另一可能的原因是糖基化转移酶异常造成糖基化后AFP构象的改变。AFP的糖链结构能与多种凝集素相作用，与不同凝集素结合的AFP分子结构蛋白部分基本相同，但糖链部分有所差异。不同的糖链决定其与凝集素的亲和力。根据亲和性的不同，可将AFP异质体分为不同类型，如扁豆凝集素(LCA)亲和型、豌豆凝集素不亲和型，刀豆凝集素(ConA)亲和型和ConA不亲和型。另有一种分类方法是将电泳获得的区带从阳极开始以1、2、3编号，结合凝集素进行命名。如使用LCA则命名为AFP-L1(LCA非结合型)、 AFP-L2(LCA弱结合型)、AFP-L3(LCA强结合型)；国内外研究已经证明AFP-L3是由肝癌细胞特异产生的。