[发明专利]土著益生微生物固体菌剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种土著益生微生物固体菌剂，其特征在于由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和固体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3770；所述的胶冻样芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3769；所述的圆褐固氮菌的保藏号为CGMCC No.3768。

2.如权利要求1所述的土著益生微生物固体菌剂，其特征在于：所述的固体培养基包括有重量百分比为以干料计50-80％的糟渣，15-30％的玉米芯粉，8-12％的麸皮，0.5-0.8％的玉米面，0.1-3％的尿素，0.2-4％的硫酸铵，再加入新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水使其含水重量百分比为45-65％，用1％的石灰水调pH 7.0-7.5。

3.一种土著益生微生物固体菌剂的制备方法，其特征在于包括有如下步骤：

A.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至pH7.0-7.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.菌种的培养：分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的一级菌种；

B.土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，氯化纳0.01-0.03％，碳酸钙0.4-0.6％，甘露醇0.8-1.2％，硫酸钙0.08-0.12％，琼脂1.8-2.2％，水80-120毫升，加热溶解，用1％的氢氧化纳调pH值6.8-7.0，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下，分装于15×1.5cm干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.土著益生圆褐固氮菌菌种的培养：取土著益生圆褐固氮菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃，48-32h，即得土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面菌种，为一级菌种；

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养：

a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 7.0-7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；

b.分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；

c.分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；

d.分别将重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合菌剂，或为四级菌种继续逐级扩大培养，用此菌剂作为制备固体菌剂的菌种；

D.固体菌剂的培养：

将含水比为60-80％新鲜的豆腐渣或粉丝渣或玉米淀粉渣或洋芋淀粉，加入经0.5-1.2％H₂SO₄处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为2～4∶1～3∶0.5～1，并加入相对于干料的0.2-4％的硫酸铵，相对于干料的0.1-3％的尿素，均匀搅拌，使其含水量达到45-65％，用1％的石灰水调pH7.0-7.5，然后加入相对于干料总量为8-12％巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合菌液，充分搅拌混合均匀后，在发酵和干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌固体菌剂。

4.如权利要求1所述的土著益生微生物固体菌剂的应用，其特征在于：所述的微生物固体菌剂应用于农作物和植物生长剂或畜禽饲料添加剂。