[发明专利]一种菊糖果糖转移酶的克隆及其高效表达

说明书

技术领域

本发明涉及源自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001的一种菊糖果糖转移酶及其编码的基因序列，菊糖果糖转移酶工程菌的构建，以及菊糖果糖转移酶高效表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

双果糖酐III(Difructose anhydride)是一种新型的非还原性双糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出现于蜂蜜、咖啡等的加工过程中。其相对甜度为蔗糖的52％，而热量值却只有蔗糖的1/15(0.263kcal/g)；性质十分稳定，74％相对湿度下不吸湿，比蔗糖更难吸湿；双果糖酐III对热和酸十分稳定，在一般食品加工条件下，几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生产时的高温熬煮而不褐变。同时双果糖酐III还具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一个甜味剂被用作减肥辅助治疗；作为一种增歧因子，可促进肠道微生物的生长，明显改善排便、利尿功能；作为促进矿物质元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等矿物质元素被人体吸收利用的程度大大提高，增进骨骼生长；在抗龋齿方面，其性质可与木糖醇、山梨醇相媲美，不被诱发蛀牙的口腔链球菌利用，不产酸。这些优点使其在食品工业中的应用有广阔的前景。

由于双果糖酐III在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生产的要求，而化学催化法有许多不利的因素，例如形成许多副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使纯化步骤变得复杂。而生物法制备双果糖酐III的原料是菊糖，其来源广泛，价格低廉，转化率高，可达75％以上，属于天然产品，符合消费者追求天然产品的消费心理，因此采用生物转化技术生产成为双果糖酐III制备研究的热点。

用生物转化法制备双果糖酐III的研究已经有30余年的历史，1973年Uchiyama T.首次从产脲节杆菌中发现了一种新型菊糖酶(inulase II)，它将菊糖降解为双果糖酐III和少量的低聚果糖，由于此酶具有分子内转果糖基反应，因而将其命名为菊糖果糖转移酶(inulin ftructotransferase，IFTase，EC 2.4.1.93)。迄今为止，已发现十余种微生物可以产生此酶，主要集中在节杆菌属，包括Arthrobacter ureafaciens 7116、Arthrobacter ilicis OKU17B、Arthrobacterglobiformis C11-1、Arthrobacter sp.H65-7、Arthrobacter sp.A-6、Arthrobacterpascens T13-2、Arthrobacter sp.Bu0141、Arthrobacter sp.L68-1，另外在三种其它菌属中也发现了此酶，如Flavobacterium sp.LC-413、Bacillus sp.snu-7、Leifsonia sp.T88-4。

关于菊糖果糖转移酶的分子生物学研究始于1997年，Sakurai等人将Arthrobacter sp.H65-7的菊糖果糖转移酶基因转入大肠杆菌中，得到了首个菊糖果糖转移酶基因开放阅读框，且将其酶活由初始野生菌的胞外80U/mL提高到胞内酶活170U/mL。随后Arthrobacter sp.A-6、Arthrobacter globiformis C11-1、Arthrobacter sp.Buo141、Bacillus sp.snu-7的菊糖果糖转移酶基因也在大肠杆菌中克隆表达，其中Arthrobacter sp.Buo141菊糖果糖转移酶基因ORF长1434bp，编码477AA，1-59AA为信号肽，成熟酶胞内表达，酶活提高到320U/mL。

本发明将具有较高酶活的金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001的菊糖果糖转移酶基因在大肠杆菌中胞外表达，酶活较高，具有较好的工业应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种菊糖果糖转移酶及其编码的基因序列，菊糖果糖转移酶工程菌的构建及诱导表达的方法。该菊糖果糖转移酶在较高温度下具有较好的活性和稳定性，对于新型功能性甜味剂双果糖酐III的工业化生产具有广泛的应用前景和经济意义。