[发明专利]一种适用于病毒PCR检测的标准品的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于病毒定量检测的标准品的制备方法。

背景技术

粪口途径传播的病毒可以通过生物体排出的粪便进入环境中，再通过饮用水和食物传播感染宿主，主要引起肠胃炎以及相关的并发症。近年来，这类病毒的感染和大规模爆发频频发生，粪口途径传播的病毒的检测和控制，已经成为了公共卫生领域的研究重点。与水体污染有关的主要病毒类群包括：细小RNA病毒科，杯状病毒科，腺病毒科，呼肠孤病毒科，戊肝病毒科等。它们可以引起慢性肠道炎、肝炎，甚至能引起脑膜炎等严重的疾病。

传统的病毒检测方法包括细胞培养和病毒抗原-抗体反应，然而这两种方法的检测周期长，步骤繁琐，灵敏度偏低，有时容易出现假阳性或假阴性。自20世纪90年代初，PCR方法成为了环境样品中病毒检测的主要手段，具有样品处理步骤简单，检测周期短，特异性强的优点。PCR能够准确地检测具有一定病毒浓度的样品，如土壤，粪便，污水。但是，对于饮用水或自来水这类病毒含量很低的样品，PCR的灵敏度仍然有待提高。

常规的PCR结果只能定性地分析样品中的病毒，仍然不能满足对环境中致病病毒进行定量监测的要求。近几年来，越来越多的研究者开始应用实时荧光定量PCR检测方法。定量PCR可以定量分析样品中的病毒含量，相比普通PCR具有更高的灵敏度和特异性，从而达到了实时检测样品病毒浓度变化情况的要求。特异病毒的定量PCR检测首先需建立该病毒的扩增标准曲线，主要基于病毒纯培养核酸提取后，将用病毒特异性引物扩增的片段克隆入质粒载体后制备成病毒标准品，再根据梯度稀释的质粒标准品的荧光定量结果绘制标准曲线。

这种标准曲线的建立方法有三个弊端：1）人类致病病毒的细胞培养费时费力，若要同时建立多种病毒的定量PCR条件周期会非常长；2）国家对于人类致病病毒的保存，运输和用途有非常严格的要求和管制条例，一般的实验室很难满足操作这些致病病毒的要求，从而限制了一般实验室的相关研究。3）在致病病毒使用过程的存在安全隐患，如果使用不当，操作人员可能会感染相关疾病。4）由于病毒种间相似度很低，多种病毒的检测需要设计不同的引物；在存在PCR抑制剂的环境样品中，需要用多种病毒的阳性对照来评估PCR扩增的抑制情况，这些需要对每种病毒的标准样，从而给PCR条件的优化带来了困难。

本发明通过常规的分子生物学方法制备出包含病毒引物的大肠杆菌质粒，这个方法安全性高，操作流程简单，适用于一般实验室进行环境中病毒PCR检测以及定量PCR的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全简便的，用于定量PCR标准曲线和PCR条件优化的病毒标准品的制备方法。

本发明的提供的病毒质粒标准品的制备方法，是指不需要使用相关病毒的细胞培养，仅使用合并引物制备带有该病毒上下游引物的质粒标准品的方法。

本发明方法的具体步骤如下：

1）  根据病毒引物的扩增片段大小筛选合适的大肠杆菌16S rRNA基因引物；

2）  设计包含病毒特异性引物和大肠杆菌引物的合并引物；

3）  用合并引物扩增大肠杆菌16S rRNA基因片段；

4）  制备病毒PCR检测标准品质粒。

上述方法中，所述筛选大肠杆菌16S rRNA基因的引物，并不限于大肠杆菌或16S rRNA基因，可以根据已知病毒的引物对该病毒基因组扩增片段的大小，通过软件寻找在大肠杆菌16S rRNA基因中扩增相近片段长度的合适引物。

上述方法中，所述设计合并引物，是将病毒和大肠杆菌的上游引物和两者的下游引物分别进行合并，通过软件筛选出扩增效率最佳的合并引物。 

上述方法中，所述扩增大肠杆菌16S rRNA基因片段，是以大肠杆菌基因组为模板，用设计的合并引物扩增大肠杆菌16S rRNA基因，得到两端带有病毒引物的16S rRNA基因片段。 

上述方法中，所述制备病毒标准品质粒，是利用DNA重组技术将带有病毒引物的16S rRNA基因片段克隆到载体中，构建的重组质粒作为检测该病毒的PCR检测的标准品。

上述方法中，所述病毒标准品质粒，包括肠道病毒、甲肝病毒、手足口病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒、人星状病毒、戊肝病毒等致病病毒的标准品质粒，但不局限于这些病毒，还包括其它致病细菌和真菌的标准品。

上述方法中细节内容进一步描述如下：

1.  设计特定片段大小的大肠杆菌16S rRNA 基因上下游引物。