[发明专利]重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种重金属检测技术领域的方法，具体是一种重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法。

背景技术

近年来，随着工农业迅速发展，重金属污染日益加剧，造成的环境及食品安全问题也日益突出。重金属主要通过水循环，经由饮用水及农产品等途径，进入人体，威胁人们健康。污染水体的重金属主要包括Hg、Cd、Cr、Cu、Co、Ni等，其中Hg的毒性最大，因此快速检测重金属汞污染现状，显得尤为重要。目前，重金属的检测分析方法主要有：原子吸收光谱分析(AAS)、电感耦合等离子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子质谱分析(ICP-MS)、原子荧光光谱分析(AFS)等。这些检测方法虽然可以精确地测定重金属的含量，但需要对样品做繁琐的预处理步骤，检测过程需在配备大型分析仪器的室内进行，且需要专业的仪器操作员，检测费用也代价高昂，难以快速、简便、费用低廉地检测环境中的重金属汞。

经过对现有技术的检索发现，Reardan等人于1985年首次利用螯合剂螯合金属制备单克隆抗体以来，重金属免疫学检测方法受到了国内外的广泛关注，尤其是近些年相关研究越来越多，多种重金属包括Cd²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、U⁶⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等螯合剂复合物的抗体均有研究报道，其主要集中于单克隆抗体。

进一步检索发现，Huan He等在Analytical Letters(42：409-424，2009)上公开了用EDTA衍生物螯合镉制备多克隆抗体进行间接酶联免疫吸附的研究。多克隆抗体就特异性而言不如单克隆抗体，但其检测方法也可以达到一定的检测要求。青霉素G盐作为双功能螯合剂连接重金属汞及大分子蛋白，藉此作为免疫原制备多克隆抗体，建立IC-ELISA，未见报道先例。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法，针对水样中汞离子的检测限为14.5μg/L，对汞离子具有很高的特异性，可以运用于重金属污染地区及污染样本的快速检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种重金属汞多克隆抗体的制备方法，通过将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原MMPA-OVA，最后经对免疫原MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体，其反应式如下：

所述的将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞是指：取青霉素G钠盐或钾盐的水溶液中加入咪唑，搅拌溶解后逐滴加入HCl并调节pH到6.8，然后加入HgCl₂经水浴反应并冷却后产生黄色粉末状沉淀，最后再加入HCl并震荡离心处理后弃去上清，得到青霉烯酸硫醇汞盐。

所述的与大分子载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联是指：采用碳二亚胺法和载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)加入青霉烯酸硫醇汞盐，经室温反应并透析后得到免疫原Hg-青霉素-BSA和包被原Hg-青霉素-OVA。

所述的偶联中采用紫外吸收法对完全抗原进行扫描，并且对完全抗原中的蛋白含量和重金属汞的含量进行测定，分别采用考马斯亮蓝法和电感耦合等离子发射光谱法，确定抗原是否合成成功

本发明涉及上述重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测定方法，包括以下步骤：

第一步、酶联免疫吸附测定方法，包括用棋盘法优化多克隆抗体及包被抗原工作浓度，建立IC-ELISA，绘制出标准曲线，具体为：将重金属汞多克隆抗体加入到孔底固定有表面半抗原的酶标板孔中，使待测抗原与固相载体表面半抗原竞争抗体表面的结合位点。

第二步、优化二抗、包被缓冲液、包被介质工作浓度，具体为：加入酶标记的二抗，二抗与结合在固相载体表面抗原上的抗体反应，也固定在固相载体上，使得底物被酶催化成为有色产物，而产物的量与待测重金属标准溶液的量相关，呈现的颜色通过紫外光一定波长下测定吸光度值，以进行定性或定量分析。

第三步、检验该IC-ELISA方法中其他金属Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺的干扰，建立对水样的添加回收实验，实现对酶联免疫吸附的测定。