[发明专利]一种由Pseudomonas.sp.HZJ216生产的褐藻胶裂解酶

说明书

技术领域

生物技术

背景技术

褐藻胶是褐藻细胞壁和细胞间质的主要组成部分，也是褐藻中含量较高的一种多糖，其分子是由β-D-1，4-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，简称M)和α-L-1，4-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid，简称G)两种单体组成的嵌段式线性聚合物，其分子中存在三种嵌段：均聚甘露糖醛酸(M)_n，均聚古罗糖醛酸(G)_n和M、G两种单体交替(MG)_n的嵌段。褐藻胶裂解酶的酶解反应都是在底物的非还原末端生成4-deoxy-erthro-hex-4-enopyranuronosyl基的β消除反应。1992年，Gaseca报道了关于褐藻胶裂解酶的裂解机制，褐藻胶分子中的羧基与酶分子中的阳离子性氨基酸残基结合，C5位的C-H电子对被6位的羧基吸引，5位的C-H结合变弱，然后又一个酶分子中的亲核性氨基酸残基与C5位的质子结合，电子向着生成稳定的中间体的方向运动，最终在C4-C5间生成双键，所以褐藻胶酶解的产物分子中的非还原末端产生C4，5不饱和双键，在230~240nm有强吸收。据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，迄今为止报道的褐藻胶裂解酶大多是从海洋生物如褐藻、海洋软体动物、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、病毒中分离纯化而来的，陆上生物分离得到的褐藻胶裂解酶全部来源于细菌、黄杆菌(Flavobacuterium multivolum)、Alginovibrio aquatilis、固氮菌(Azobactervinelandii)、克里伯氏菌(Klebsiella aerogene)、(Klebsiella pneumoniae)、肠杆菌(Enterobacter cloacae M-1)、别单胞菌(Alteromonas sp.)、芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、(Agarbacterium alginicum)。专利公开了一种Vibria sp.QY101产生的其特征为酶的分子量为39kD的褐藻胶裂解酶。Vibria sp.QY2产生的其特征为酶的分子量为28.5Kd。Vibria sp.QY1产生的其特征为酶的分子量为39kD等，经检索未见有假单胞菌属的细菌产生的与其相同的褐藻胶裂解酶。

发明内容

本发明分离纯化出一株来源于海藻的菌株Pseudomonas.sp.HZJ216，其具有产生褐藻胶裂解酶的特性，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCCNO：M209241。本发明的目的是提供一种来源于海洋的菌株Pseudomonas.sp.HZJ216，利用该菌株生产褐藻胶裂解酶。

本发明的特点如下：首次分离出产褐藻胶裂解酶Pseudomonas.sp.HZJ216菌株。该菌株为不产孢子的弯杆状，革兰氏阴性。不抗酸，没有荚膜，在标准肉汤上生长良好，氧化酶阳性，无色素和黄色，脲酶阳性。0.4-0.7μm×1.3-1.5μm，端生单鞭毛。该菌株分离自海水，3％和7％NaCl胨水中生长良好，经过biolog鉴定和基因测序，确定其为假单胞菌属，命名Pseudomonas.sp.HZJ216。此菌株在2216E培养基上26℃培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。在发酵产酶培养基中培养18h，其发酵液中褐藻胶裂解酶的活力达到最高。用本发明的菌株作为褐藻胶裂解酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的褐藻胶裂解酶的分子量分别为60.25kDa(图1)。其分子量不同于已报导的该菌褐藻胶裂解酶。通过丙酮沉淀、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex 75凝胶、Superdex HS-100凝胶过滤技术对Pseudomonas.sp.HZJ216菌株产生的褐藻胶裂解酶进行纯化和精制，获得一种电泳纯度的酶蛋白组分，将纯化出的酶蛋白经过Edman法降解后进行蛋白质N末端测序，此种酶的N端氨基酸序列为Gln-Asp-Arg-His-Gly-Val。此蛋白的N端不同于任何已报道的褐藻胶裂解酶的N端序列，此酶与其它的褐藻胶裂解酶的N端进行比较可知此蛋白的N端氨基酸序列不同于任何已报道的褐藻胶裂解酶的N端序列，为一个新酶，该菌株产酶具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。其发酵液中褐藻胶裂解酶的活力达到1980U/ml.

附图说明