[发明专利]一种丙型肝炎病毒特异性抗原及其在血清分型中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种丙型肝炎病毒血清型检测技术，具体地说涉及一种丙型肝炎特异性抗原以及采用酶联免疫技术检测丙型肝炎病毒血清型特异性抗体的方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起输血后病毒性非甲非乙型肝炎的主要病原，主要通过输血、静脉吸毒传播，也可通过密切接触和母婴传播。目前全世界约有1.7亿HCV感染者。一般地，15～20％左右的HCV感染者为自限性感染，超过80～85％的感染者发展为慢性丙型肝炎，其中又有20％的可发展为肝纤维化，最终有4～5％的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。

HCV基因组全长9400nt，共编码C、E1、E2、NS3、NS4、NS5等蛋白。目前，慢性丙型肝炎主要治疗方案是干扰素加利巴韦林联合治疗。治疗前应进行HCV RNA基因分型(1型和非1型)和血中HCV RNA定量，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量。因此，HCV基因型的检测在慢性丙型肝炎的治疗中具有重要作用。

由于HCV基因组具有极高的变异性，根据选择的区段的不同，不同学者采用不同的HCV分型方法，命名也不尽相同。一般说，国际上通常采用的分型方法有两种，一种是Simmonds基因分型法，主要是采用测序法分析NS5区222bp的变异情况，将HCV基因型分为1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a、6a等6个主要的基因型和11个亚型，伴随大量新HCV基因的克隆测序工作的进行，目前，HCV已经发现有30多个亚型；另一种是Okamoto基因分型法，主要采用型特异性引物扩增C区基因，根据扩增片断的长度，将HCV分为I-IV四个主要的基因型。不同分型方法之间有一定的关联性，象Simmonds确定的1b亚型相当于Okamoto分型的II型；而2a亚型相当于III型。除此以外，对E1区的测序分析可以正确的区分I/1a、II/1b、III/2a、IV/2b、2c(V)、3a、4a、4b、4c、4d、5a、6a共12种不同的基因型或亚型。临床研究显示：1b型HCV感染者IFN疗效较差，而2a型感染者IFN敏感性较好。来自流行病学的研究显示，在我国，1b、2a两种亚型感染率接近97％，因此，如何区分1b、2a感染在我国临床HCV治疗中具有独特的重要作用。

目前，对HCV基因分型的方法除了序列分析法外，还增加了型特异性引物PCR扩增法、型特异性探针杂交法、限制酶切多态性分析等方法，尽管后续方法降低了测序费用及缩短了检测时间，但仍需要HCV基因提取等过程，一般实验室难以开展。另外，当HCV-RNA阴性或由于保存不当及处理过程中HCV-RNA遭到破坏时，则不能进行基因分型。

鉴于上述情况，有些学者提出了血清学分型，即筛选HCV各基因型特异性抗原表位，合成相应多肽，采用间接酶联免疫技术，根据患者体内型特异性抗体的存在情况，进行HCV的血清学分型。目前，日本学者根据不同HCV基因型中C区氨基酸序列的差异，人工合成2条多肽，血清1型多肽代表Okamoto分型的I和II型(Simmonds分型的1a、1b)，血清2号多肽代表Okamoto分型的III和IV型(Simmonds分型的2a、2b)，基于C区的血清分型与基因分型具有较高的符合率，但分型率只有45％，但具有很高的特异性；基于NS4血清分型试剂可以检测1-6型，分型率为83％；与基因分型的符合率为87％，目前，Murex已经推出NS4血清分型的商品化试剂，但价格昂贵，且结果判断复杂。

造成血清分型率低的原因主要在于单独使用C区、NS4抗原进行血清学分型，其抗体检出率偏低。事实上，HCV感染者体内针对HCV病毒产生的抗体情况十分复杂，存在针对多个不同区的抗体，因此，HCV诊断通常通过采用多抗体联合诊断的手段提高HCV抗体的检出率。而近些年对膜区E1、E2抗原的研究进展，超过90％以上的HCV慢性感染者体内都存在针对膜区的抗体，但由于E1、E2抗原难以大量纯化，直接影响膜区抗体在HCV检测中的应用，也影响其在HCV血清分型中的进一步应用。

C区型别特异性抗原表位的位置主要位于65-81aa区间，但不同研究中选择的序列并不相同，缺少进一步核实；NS4型别特异性抗原表位的位置并不固定，其大体范围位于1690-1711范围类，有15-21个氨基酸组成，尚需要对其型别特异性表位进行精确分析。而关于膜区型别特性抗原的鉴定至今未见报道。