[发明专利]一种高效表达重组蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种采用动物细胞流加培养方式高效表达重组蛋白的方法。

背景技术

动物细胞大规模培养已经被广泛应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、病毒疫苗、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的能力，能够高效地表达和生产各类高质量的蛋白质。

动物细胞培养无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，主要分为分批式(Batch)，流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三种操作方式。简单的分批培养(Batch)中，随着营养物的消耗和副产物积累，细胞停止生长并开始死亡，产物也停止表达，生产效率很低。流加培养(Fed-batch)，即在培养过程中，根据细胞代谢需求，连续或间歇地向反应器内加入特定的流加培养基，补充新的营养物质，减少副产物，克服了批培养的弊端。流加培养同批培养相比，培养周期延长，能够最终获得更高的活细胞密度和产物浓度(J.B.Griffith，Animal Cell Culture and Production of Biologicals，pp.401-410，Klumer Academic Publishers，R.Sasaki and K.Ikura(eds.)，(1991)，Robbinson DK，Seamans TC，et al.optimization of a fed-batch process for production of a recombinant antibody.Annals NY Academy Sciences，(1994)，745：185-296)。连续灌流培养(Perfusion)是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将消耗过的培养基排出，同时又连续不断地灌注新的培养基的方法。目前，流加式(Fed-batch)培养是动物细胞大规模培养生产分泌型重组蛋白药物较为推崇的一种操作方式。

此外，动物细胞大规模培养的有关研究内容还包括高密度和高表达细胞的培养环境及条件，促进单个细胞的基因合成和产物表达，改进培养系统的氧传递方式，以及减少剪切力和降低生产成本的培养条件等。其中，培养温度是影响重组蛋白生产的重要因素之一，优化培养温度，可提高重组蛋白的产量，与其他方法相比，此方法操作简便，有较好的实用价值。CN 200510011774.5(发明名称为：一种高效表达目的蛋白的方法)公开了一种高效表达目的蛋白的方法，该方法通过优化稳定表达目的蛋白的工程化CHO细胞株的培养温度，并利用两阶段培养策略，使融合蛋白表达量得到显著提高。但一些研究表明，仅通过优化培养温度，并不能使重组蛋白的产量提高到理想水平(Yoon SK，Song JY，Lee GM.Effect of low culture temperature on specific productivity，transcription level，and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng.2003，82(3)：289-98)，这是因为降低培养温度可提高目的蛋白的比生成率，但同时导致细胞增殖抑制，降低了细胞的相对数量，从而影响了目的蛋白产量的提高。而且温度不仅仅是影响重组蛋白表达的唯一因素。因此，结合优化培养温度综合考虑其它因素使重组蛋白高效表达是本领域技术人员一直期待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的申请人公开了一种高效表达重组蛋白的方法，其中重组蛋白为抗IgE单抗，本方法采用动物细胞流加培养方式，包括如下步骤：

(1)细胞培养温度36℃-38℃，pH值6.5-6.9，培养24-48小时，当动物细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；

(2)细胞培养温度降至32.5℃-35℃，pH值7.0-7.3，进行流加培养；

(3)停止流加，细胞培养温度升至36℃-38℃，pH值7.0-7.3，进行培养。

本发明选择动物细胞流加培养方式进行重组蛋白的表达，并在流加培养的不同阶段控制不同范围的细胞培养温度和pH值，通过增加单位体积的细胞数量和单个细胞的蛋白表达量以期达到重组蛋白高效表达的目的。