[发明专利]协同降解石油的复合菌液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于污染海洋环境生物修复技术领域，具体涉及基于海洋“专性解烃菌”(the obligatehydrocarbonoclastic bacteria，OHCB)协同降解石油效应的一种复合菌液及其制备方法。

背景技术

海洋溢油的频繁发生不仅给海洋养殖业、旅游业等造成巨大的经济损失，还会对海洋生态环境及人类健康造成长远的负面影响。因此，如何消除海洋溢油污染、修复受损海洋生态环境成为海洋环境保护的重要内容之一。生物修复技术由于具有成本低、较彻底、无二次污染等优点，逐渐成为处理溢油的一种有效途径。

海洋专性解烃菌是一类溢油发生前在海洋环境中丰度很低甚至低于检测限，溢油发生后可以迅速增殖并以石油组分为唯一碳源和能源的微生物。它们当中包括Alcanivorax(食烷菌属)、Cycloclasticus(解环菌属)、Marinobacter(海杆菌属)、Marinobacterium(海细菌属)、Neptunomonas、Oleispira(油螺旋菌属)、Thalassolituus等属的细菌。20世纪90年代兴起的溢油原位生物修复技术，正是通过添加海水中缺乏的氮、磷元素刺激这类细菌的生长、加快石油降解速率来实现的。由于这类细菌在溢油去除过程中作用显著，并且具有迥异于陆源耐盐降解菌的生长特性、难以获得纯培养，所以它们是一种重要的、相对稀缺的海洋菌种资源。但是采用单独一种专性解烃菌往往存在石油降解速率低、修复效果差的问题。

在溢油这种成分极其复杂的有机污染物降解过程中，在不同降解菌之间存在着各种复杂的关系，降解菌之间的协同效应是彻底降解溢油污染物的必然方式。因此，如何充分利用海洋专性解烃菌之间的协同效应、制备复合菌液对海洋溢油进行生物修复，已成为海洋溢油生物修复技术研究的难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种协同降解石油的复合菌液及其制备方法，即利用微生物之间在石油降解过程中的协同效应，用3株每洋专性解烃菌制备降解石油的复合菌液，以高效快速的对海洋岸滩溢油污染环境进行生物修复。

本发明涉及的复合菌液的菌种为2个种、3株海洋专性解烃菌，其中1种(2株)是食烷菌(Alcanivoraxsp.)，另外1种(1株)是海杆菌(Marinobacter sp.)；上述3株细菌已分别于2009年8月20日、2010年4月16日保藏至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.3735(菌株Alcanivorax sp.97CO-5)、CGMCC No.3736(菌株Alcanivorax sp.97CO-6)、CGMCC No.3244(菌株Marinobacter sp.PY97S)，其纯培养的主要特征如下：

(1)菌株PY97S能够降解包括萘、2-甲基萘、2，-二甲基萘、联苯、苊、芴、菲、蒽、二苯并呋喃、二苯并噻吩、苯并[α]芘在内的至少11种PAHs。采用GC-MS测定了菌株PY97S对典型PAHs菲的降解率，发现它对初始浓度为0.2g/L的菲在10d后的降解率可达到99％。

(2)菌株97CO-5、97CO-6均能够以原油或柴油为唯一碳源和能源生长，并且都能够将含有原油的培养基的表面张力从58mN/m降低至28～30mN/m，说明这些菌株可以产生生物表面活性剂以提高传质速率，加快石油降解过程。

本发明的技术方案为：

1、协同降解石油的复合菌液：

(1)本发明的复合菌液是由食烷菌97CO-5、食烷菌97CO-6和海杆菌PY97S的发酵培养液组成：将对数生长后期(OD₆₀₀分别为0.5～1.5，细胞密度为10⁸～10⁹CFU/mL)的3株海洋专性解烃菌(97CO-5、97CO-6、PY97S)的发酵培养液均匀混合制成复合菌液；

(2)本发明的复合菌液中3株菌的细胞浓度均为10⁷～10⁹CFU/mL。

2、食烷菌97CO-5、食烷菌97CO-6和海杆菌PY97S的发酵培养液制备步骤如下：

(1)制备种子液：将超低温(-80℃)保藏的菌种分别接入50mL～10L的M8培养基或乙酸钠培养基，在18～35℃、50～200rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，分别制备三种种子液；