[发明专利]氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于医疗技术领域，涉及一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的制备以及将其用于改善与血液接触医疗设备的血液、生物相容性的涂层方法，特别涉及一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层体外循环管道的制备方法。

背景技术

体外循环是目前心脏外科的常规技术。体外循环主要由连接管道、氧合器、贮血器、动脉微栓过滤器等部分组成，其构成材料多为聚氯乙烯、聚四氟乙烯、涤纶、聚乙烯、硅橡胶和不锈钢等化学物质。由于这些人工合成材料的生物相容性欠佳，与血液接触后可引起机体的体液和细胞激活(尤其是补体系统)，从而导致患者术后发生全身炎症反应综合症、败血症以及多器官功能衰竭等并发症，直接影响患者术后的康复。

体外循环管道表面改性是改善其生物相容性的重要手段。在众多的表面改性处理方法中，肝素涂层技术因具有操作方法简便、效果确切、价格合适等特点而首先获得了临床认可和商品化应用。大量的相关实验研究和临床应用表明肝素涂层能够有效改善体外循环管道的生物相容性，降低血液的激活，减少炎性因子和氧自由基的产生，从而减轻患者术后的全身炎症反应。肝素涂层技术是体外循环管道表面改性的一个重要里程碑，然而由于肝素分子本身的特性，肝素涂层表面仍具有对血浆蛋白吸附不具选择性和不能完全阻止手术创面所介导的血液激活等局限，而血浆蛋白吸附则恰恰是引起血液与人工材料表面相互作用的始动因素。

以往有研究人员成功合成出了一种基于非酶糖基化反应的抗凝血酶-肝素共价复合物(以下简称复合物)，并对其进行了一系列研究，发现该复合物具有强大的直接和间接抑制凝血酶活性，其对血浆蛋白和内皮细胞的吸附较肝素明显减少，更令人欣喜的是该复合物还能抑制纤维蛋白结合的凝血酶活性和使结合有凝血酶的纤维蛋白血栓具有抗凝血活性，从而能有效的抑制手术创面所介导的血液激活（见ThrombosisResearch，2007，120(2)：151-160）。该复合物的制备方法主要涉及抗凝血酶赖氨酸残基的ε-氨基与具有抗凝血酶结合特异五糖及醛糖共同末端的肝素分子发生非酶糖基化作用和丁基-琼脂糖快流速疏水层析及二乙基氨基乙基-琼脂糖快流速阴离子交换层析。然而，由于这种特殊末端的肝素分子在天然肝素分子中比例仅约为0.4%，且两步层析纯化过程中复合物会有所消耗，故该方法最终获得的复合物合成率约为50%。

另外，最近有研究表明高碘酸钠能有效地将肝素分子中的羟基氧化为醛基，并且肝素分子量的大小与其对血浆蛋白和内皮细胞的吸附性成正相关。（见JBiomedMaterResA，2007，86A(3)：648-661和ThrombHaemost，2004，91(5)：1009-1018）。

发明内容

本发明针对肝素涂层体外循环管道仍具有对血浆蛋白吸附不具备选择性和不能完全阻止手术创面所介导的血液激活等技术缺陷，制备一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物，并应用聚乙烯亚胺-戊二醛结合技术将其固定于体外循环管道表面，以进一步改善体外循环管道的生物相容性。

为了实现上述技术任务，本发明提供一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物制备方法，利用该方法制得的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物作为涂层剂应用于体外循环管道涂层技术中，进一步改善体外循环管道的生物相容性。本发明所制备出的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层体外循环管道具有较肝素涂层和低分子量肝素涂层体外循环管道更佳的涂层稳定性、抗凝血性能和生物相容性，减轻了血液与体外循环管道表面接触所引起的炎性介质生成、释放和凝血系统激活。

本发明采用如下技术方案实现上述技术目的：

一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）将高碘酸钠和低分子量肝素钠注射液进行室温避光反应，然后采用离心超滤装置进行超滤离心，得到氧化低分子量肝素钠溶液。

（2）将上述氧化低分子量肝素钠溶液与抗凝血酶在磷酸盐缓冲生理盐水中进行第一次水浴反应，促使氧化低分子量肝素的终末醛糖残基与抗凝血酶的赖氨酸残基的ε-氨基发生非酶糖基化反应而生成希夫碱，并进而发生阿马多利分子重排形成稳定的共价复合物，然后加入氰基硼氢化钠溶液进行第二次水浴反应，以还原未发生阿马多利分子重排的希夫碱。

（3）将步骤（2）得到的混合溶液首先通过离心超滤装置进行超滤离心；然后用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液透析；随后利用二乙基氨基乙基-琼脂糖快流速阴离子交换层析进行纯化；最后经过磷酸盐缓冲生理盐水透析，得到氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物溶液。