[发明专利]一种酶蛋白环化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的酶蛋白环化方法，以提高蛋白酶的性能，特别涉及双内含肽介导的酶蛋白环化方法。本发明还涉及一种增强热稳定性的环化木聚糖酶。

背景技术

许多天然的酶在应用中存在着许多性能上的不足，如热稳定性低。酿造、饲料工业中的高温制粒的过程需要75℃-90℃温度，并持续数分钟，在此过程中会大幅的丧失酶的活性，限制了天然酶在工业生产中的应用。因此提高酶的热稳定性成为急需解决的问题。

体外蛋白环化是一种新技术，环化后可增加蛋白的热稳定性，减少蛋白对水解酶剪切的抗性，同时也可增强蛋白的化学抗性。2000年Thomas C.Evans和Ming-Qun Xu利用Ssp DnaE内含肽，在体内环化了有395个氨基酸的麦芽糖结合蛋白，此种内含肽环化方法的缺点是不利于进行体外环化，因此实现体外蛋白的环化是需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是开发一种新的体外酶蛋白环化技术，提供具有热稳定性的环化酶。技术解决方案

本发明提供了一种环化的酶，其特征在于，其酶蛋白的N、C两端相链接。

本发明提供了一种环化酶蛋白的方法，包括整套表达载体的构建、重组子的筛选及环化分子的鉴定方法，其特征在于通过两种内含肽介导环化酶蛋白质，用天然的肽键将酶蛋白的N、C两端链接起来。

所述二种内含肽是集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)Ssp DnaB内含肽(GenBank为DQ371396.1)和蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)Mxe GyrA内含肽(GenBank为U67876.1)。

用发明的方法可以对多种天然酶蛋白进行体外环化，其限制条件是酶蛋白的多肽序列的第一个氨基酸是半胱氨酸，且酶蛋白的三维晶体结构已知，同时酶蛋白的N、C两端应位于蛋白结构的同侧。

在本发明的一个实例中，所述酶蛋白是木聚糖酶蛋白，经实验证实，环化后的木聚糖酶的热稳定性有所提高。

本发明对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的木聚糖酶基因xylB进行环化，环化方法是将核苷酸序列(GenBank为DQ100307.1)的基因在大肠杆菌中环化表达，通过两种内含肽介导木聚糖酶环化。用本发明的方法改良的木聚糖酶具有更好的热稳定性。

1.基因克隆从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组中PCR得到一个中性木聚糖酶基因xylB。

2.环化载体的构建从质粒pTWIN1(ENB公司)上PCR扩增出集胞蓝细菌Ssp DnaB内含肽的序列和蟾分枝杆菌Mxe GyrA内含肽的序列。将DnaB片段、xylB基因和Mxe GyrA序列顺序连接形成融合基因，插入到经酶切消化后的pTWIN1载体上，形成表达载体pTX。转化到大肠杆菌，获得重组子。

3.蛋白的表达和纯化加入IPTG诱导表达木聚糖酶前体，通过几丁质亲和柱得到体外的木聚糖酶融合前体。之后通过温度诱导和MESNA诱导蛋白环化的发生。验证蛋白的环化情况。

4.木聚糖酶性质的测定使用DNS法测定木聚糖酶的酶活。

附图说明

图1为大肠杆菌重组载体pTX的物理图谱；

图2表示60～90℃下，环化木聚糖酶和野生木聚糖酶在各温度保温30分钟后，剩余酶活的百分比；

图3为SDS-PAGE电泳鉴定蛋白环化情况。图中1为蛋白酶切割后的线性蛋白，2为环化木聚糖酶。

具体实施方式

下面具体实施例中，用木聚糖酶的环化过程进一步阐述本发明的环化方法。应理解，该实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不限制所用酶蛋白的范围。

实验条件

菌株与载体大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司，pTWIN1质粒购自ENB公司。

酶与试剂盒限制性内切酶，连接酶，Taq酶，Factor Xa为NEB公司产品。基因组提取试剂盒为天根生化公司产品。

生化试剂DNA合成试剂为Millipore公司产品。引物合成为ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS、木聚糖及MESNA为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。木糖、磷酸二氢钠和柠檬酸为国产分析纯。几丁质树脂和Factor Xa为NEB公司产品。