[发明专利]草鱼白细胞化学吸引素2基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼白细胞化学吸引素2基因的核苷酸及氨基酸序列。

背景技术

LECT2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2)最早分离自人T细胞SKW-3株培养液，它具有嗜中性粒细胞趋化活性，其在人肝脏中特异表达并分泌到血液中。而新近的研究揭示，LECT2可能是一个多功能的蛋白，其与细胞生长、分化、损伤修复及免疫等过程相关。有多种动物的白细胞化学吸引素基因已被克隆，例如牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、斑马鱼(Danio rerio)和大黄鱼(Pseudosciaena crocea)等物种。

目前白细胞化学吸引素2基因在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲料提供理论依据和新思路。

发明内容

本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中白细胞化学吸引素2基因EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼白细胞化学吸引素2基因的全表达序列。

上述目地是通过以下技术方案来实现的：

取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol(Invitrogen Corporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。

本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到白细胞化学吸引素2基因(lect2)EST序列，经测序比对后发现该EST序列欠缺cDNA序列的5’端和3‘端。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5端进行扩增。

根据Takara 5′-Full RACE Kit试剂盒，通过本实验室草鱼肠道cDNA文库中白细胞化学吸引素2基因EST序列设计5端(GSP5)和3端(GSP3)两个特异引物：

GSP5：5’-CAACTTCACATCAAATGGAGCAA-3’

GSP3：5’-GAGACCTGTTACAAATTAAATTCCAAG-3’

分别对应试剂盒中：

5’-CDS primer A：5’-(T)₂₅VN-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，C)

3’-CDS primer A：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀VN-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，C)

以TRIzol一步法提取总的RNA为模板，进行5‘-RACE反应和3’-RACE PCR反应。

反应结束后，取5～10l PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。分别得到大小为400bp和300bp左右的清晰条带。

PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后连接到pMD19-T质粒，转入E.Coli DH5α菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。

将测序结果和已知EST序列拼接所得序列进行比对，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼白细胞化学吸引素2基因序列，既目的基因。

通过该基因的原核表达和蛋白免疫印迹(Western blotting)，证实该基因的表达蛋白为lect2蛋白。进一步证实该基因确为lect2基因。

草鱼肠道细胞白细胞化学吸引素2基因序列的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲料提供理论依据和新思路。

附图说明

我们得到结果如图1所示，免疫印记条带出现在20kD位置左右。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不局限于此。

总RNA的提取

挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长340mm，约1.1冬龄(13个月)，1.3kg。取出新鲜草鱼肠道组织，液氮迅速冷冻后保存于-80℃冰箱备用。采用TRIzol(InvitrogenCorporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。

1.引物设计依据和合成方法