[发明专利]中华鲟实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及中华鲟(Acipenser Sinensis)的核酸检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

中华鲟(Acipenser Sinensis)是中国特有的古老珍稀鱼类和世界现存鱼类中最原始的种类之一，距今有一亿四千万年的历史，被誉为“水中的大熊猫”、“活化石”，现为国家一级保护动物，国际自然保护联盟(IUCN)红色名录濒危种，世界野生生物贸易公约(CITES)附录Ⅱ.

鉴于国家对中华鲟捕捞行为的明令禁止，目前，在水产市场上已难见到正宗的中华鲟，某些餐馆肆意出售所谓的“中华鲟”，相当部分是一些其他鲟类，这会造成对民众的动物保护意识的严重误导，也是对消费者的恶意欺骗。为了保护中华鲟这一鱼类珍稀品种，防止不法分子非法捕杀、携带和销售中华鲟，以及对销售假冒中华鲟行为的惩治，必须对中华鲟有一种快速、准确的鉴定手段或方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速准确地进行中华鲟的检测的中华鲟实时荧光PCR基因检测试剂盒及用其检测中华鲟的方法。

本发明用于中华鲟实时荧光PCR基因检测的试剂盒包括如下试剂：

(1)PCRMIX反应液：由5×FQ PCR buffer、浓度为10μM的DL基因引物混合物、浓度为10μM的荧光探针、浓度为10mM的dNTPS及ddH₂O；其中DL基因引物混合物含有上游引物和下游引物，

所述上游引物DL-F序列为：

5’-GATCAAGGTATGTCGATGACA-3’；

所述下游引物DL-R序列为：

5’-CAAGAACACAAGATTAATGAG-3’；

所述荧光探针DL-P序列为：

5’-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3’，其5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；

(2)Taq酶；

(3)阳性对照：浓度为1×10⁷copies/mL的中华鲟的DL基因扩增片段重组质粒。

上述5×FQ PCR buffer、浓度为10μM的DL基因引物混合物、浓度为10μM的荧光探针、浓度为10mM的dNTPS及ddH₂O按体积比为10∶1∶0.5∶1∶30.5。

本发明还提供检测中华鲟的方法，包括如下步骤：

(1)按常规方法提取样品的DNA；

(2)对提取的DNA进行扩增反应；反应体系中含有：PCR MIX反应液24μL、Taq酶2μL，样品DNA提取液4μL，阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH₂O；反应程序为：93℃反应2min，93℃反应30s，58℃反应45s，45个循环；

(3)结果分析：如果Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为阳性，即样品鉴定为中华鲟。

本发明试剂盒由于引入了针对中华鲟的DL基因序列的特异引物和荧光探针，用于中华鲟实时荧光PCR检测，使中华鲟检测的灵敏度和特异性得到很大程度的提高，具有较好的重复性和稳定性，实现了快速、高效、准确地检测中华鲟的目的。

具体实施方式

实施例1 本发明试剂盒的组成

基础试剂盒的构成及配制(或制备)如下：

(1)PCR MIX反应液：

包含5×FQ PCR buffer、浓度为10μM的中华鲟DL基因引物混合物、浓度为10μM的荧光探针、浓度为10mM的dNTPS和ddH₂O，依次按体积比10∶1∶0.5∶1∶30.5混合；

上述5×FQ PCR buffer如下配制：按250mM的Tris-HCl(pH8.0)、35mM的MgCl₂、250mM的KCl以及体积浓度为10％的DMSO混合；

上述中华鲟DL基因引物混合物包含上游引物和下游引物，该上、下游引物及荧光探针序列如下：

上游引物DL-F：5’-GATCAAGGTATGTCGATGACA-3’；

下游引物DL-R：5’-CAAGAACACAAGATTAATGAG-3’；

荧光探针DL-P：5’-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3’，5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

dNTPS和ddH₂O按照常规方法制备。

(2)Taq酶：购自大连宝生物有限公司。

(3)阳性对照：