[发明专利]用于检测霍乱弧菌O1群的引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测霍乱弧菌O1群的引物和试剂盒。

背景技术

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)属于弧菌属，是霍乱的病原菌，霍乱是一种烈性肠道传染病，是流传时间长、影响范围广的一种食源性疾病，其典型临床表现为腹泻、呕吐和由此引起的体液丢失、脱水、周身循环衰竭、电解质紊乱、低钾综合症、腹部痉挛甚至死亡，被世界卫生组织确定为必须国际检疫的传染病之一，《中华人民共和国传染病防治法》将其列为应实施“强制管理”的甲类传染病。

霍乱肠毒素(Cholera enterotoxin，CT)是引起霍乱疾病的主要原因，产肠毒素基因的调控基因位于霍乱毒力岛(vibrio pathogenicity island，VPI)。从霍乱爆发流行分离的菌株，大部分具有耐热的菌体(O)抗原和不耐热的鞭毛(H)抗原。根据O抗原不同，目前已将霍乱弧菌分出近200个O血清型。1992年以前，仅O1群霍乱弧菌的两个生物型(古典生物型和埃尔托生物型)引发了七次霍乱世界大流行。1992年10月，在印度和孟加拉国首次发生了由非O1群霍乱弧菌引起的霍乱大暴发。

1989年2月21日中国公布的《中华人民共和国传染病防治法》，规定管理的传染病分为甲、乙、丙三类，霍乱为两种甲类管理的传染病之一。中国国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定霍乱弧菌为必检项目。霍乱弧菌的快速而准确的检测，有利于对其自然流行的监测和预防，并且对生物恐怖活动的防范具有一定的应用价值。

目前对该菌的检测，通常是在碱性琼脂平板上经选择性增菌，后通过一系列的生化方法鉴定，费时费力，一般至少要耗时4-6天。且霍乱弧菌在某些不适合生长的条件下，可形成一种存活但不可培养状态(viable butnot culturable state，VBNCS)，采用传统的免疫学方法和生物方法都不能全面的检测和鉴定霍乱弧菌。但利用核酸检测的方法，即使在不进行选择性富集培养和纯化的情况下，也可以进行检测鉴定。因此，基于核酸的检测方法比传统的富集培养的方法更具优势。

Taqman荧光PCR方法是核酸检测方法的一种，是在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。它还具有以下优点：(1)特异性强：引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。(2)灵敏度高：分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。(3)避免污染：全封闭反应，无需PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(4)实现定量：运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。(5)高效低耗：可实现一管多检。(6)操作简便：在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质，操作安全。(7)快速：反应时间＜1.5小时。正因为荧光PCR具有这些优势，目前已被广泛应用于微生物检测、疾病监测和临床检验等领域，大大提高了检测效率，缩短了检测周期，降低了检测成本，提高了经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测霍乱弧菌O1群的引物，以快速、方便地检测霍乱弧菌O1群，该引物由SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列组成。

本发明所述的引物可以用于制备用于检测霍乱弧菌O1群的基因芯片和/或试剂盒。其中所述的基因芯片优选为微列阵芯片。

本发明还提供一种用于检测霍乱弧菌O1群的基因芯片，其包含上述引物。其中所述的基因芯片优选为微列阵芯片。

本发明还提供一种用于检测霍乱弧菌O1群的试剂盒，其包含上述引物。

本发明所述的试剂盒，还包含探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明所述的试剂盒，还可以包含标准品、阳性对照、阴性对照、缓冲液(包括buffer和dNTP)和DNA聚合酶。

应用本发明所述的试剂盒检测霍乱弧菌O1群的方法如下：

(1)提取待检样品中的细菌DNA作为模板；

(2)在荧光PCR薄壁管中分别加入缓冲液、引物和探针的混合物，然后加入正对照、负对照或从检测样品中提取的模版DNA，并用ddH₂O补足到一定体积，混匀；

(3)将PCR薄壁管中混匀的混合物在荧光定量PCR仪上扩增；

(4)分析荧光定量结果并进行结果判断。