[发明专利]一种重金属铜人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种重金属铜人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

随着经济的迅猛发展重金属污染在我国越来越严重。虽然，用植物修复重金属污染土壤是当前国内外学术界的研究热点，但能有效减少环境中重金属含量的技术还停留在试验阶段，为了减少重金属从食物链进入人体，方便、简单、可靠地检测环境中重金属含量的技术是关键。现在常用的重金属检测技术，如原子吸收光谱法，电感耦合等离子体发射光谱法和动态磷光分析等技术，都需要昂贵的检测仪器和复杂的前处理，如高温、高压、强酸消化等。并且由于仪器测定条件变化与检测结果密切相关，需要非常专业的分析测试人员操作，因此，只有研究机构的中心实验室才具备测试条件，样品的检测周期相对较长，检测过程复杂，检测成本较高，不适应我国食品抽检实践中快速和简便的需要。当前，免疫检测技术已被广泛应用于毒素、杀虫剂、炸药等的环境污染和危险物的检测。与其他检测系统相比，免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏和特异的优点，可便携进行现场检测。近年来，国内外已经开展了对重金属免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对铜酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备重金属铜人工抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种重金属铜人工抗原的合成方法。所制备的产品用于重金属的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种重金属铜人工抗原的合成方法，以二乙烯三胺五乙酸DTPA为螯合剂，将铜离子与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联。

工艺步骤为：

(1)重金属铜人工抗原的合成：

称取0.147g的氯化铜溶于1mL浓硝酸中制备成铜离子溶液。

称取6mg的DTPA至1.5mL离心管中，先加入10μL的10mol/L的KOH，再加入990μL的0.1mol/L，pH值为9.7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES溶液，溶解后即制备成DTPA螯合剂溶液。

称取0.25g BSA溶于5mL、0.1mol/L、pH值为7.4的HEPES中制备成50mg/mL的BSA溶液。

先往反应器中加入520μL的DTPA螯合剂溶液，再加入12μL的铜离子溶液。在室温下、在磁力搅拌器上反应1h以上，形成半抗原反应液。

往半抗原反应液中几乎同时加入500μL的BSA溶液和200μL的0.1mol/L、pH值为9.7的HEPES，调节pH值至9.0。反应过夜后，用Cenricon-30超滤离心管对蛋白质复合物进行分离纯化。即得重金属铜人工抗原。

(2)重金属铜人工抗原的鉴定：重金属铜人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL^-1的牛血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清白蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

本发明的有益效果：本发明成功合成了重金属铜人工抗原，合成步骤简洁，有效，可完全用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对重金属研究的需要。

附图说明

图1重金属铜人工抗原制备前后的紫外扫描图。

具体实施方式

实施例1

(1)重金属铜人工抗原的合成：称取0.147g的氯化铜溶于1mL浓硝酸中制备成铜离子溶液。称取6mg的DTPA至1.5mL离心管中，先加入10μL的10mol/L的KOH溶液，再加入990μL的0.1mol/L、pH值为9.7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES溶液，溶解后即制备成DTPA螯合剂溶液。称取0.25g BSA溶于5mL、0.1mol/L、pH值为7.4的HEPES中制备成50mg/mL的BSA溶液。先往反应器中加入520μL的DTPA螯合剂溶液，再加入12μL的铜离子溶液。在室温下、在磁力搅拌器上反应1h以上，形成半抗原反应液。往半抗原反应液中几乎同时加入500μL的BSA溶液和200μL的0.1mol/L、pH值为9.7的HEPES，调节pH值至9.0。反应过夜后，用Centricon-30超滤离心管对蛋白质复合物进行分离纯化。即得重金属铜人工抗原。

(2)重金属铜人工抗原的鉴定：人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。