[发明专利]银杏防御素、编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种银杏防御素、其编码基因与应用。

背景技术

1985年美国科学家Lehrer等从人的嗜中性白细胞分离纯化出3种阳离子小肽，HNP-1、HNP-2与HNP-3，通过色谱、电泳与功能分析，将它们与以前从兔、豚鼠分离的同类小肽一起命名为防御素。后来发现这类小肽普遍存在于高等生物中，对病原微生物具有广谱的毒杀效应，是高等生物防御病原体入侵的重要防御物质。

目前所知，防御素(defensins)是一类分子量很小(一般15-30残基)，富含半胱氨酸的阳离子蛋白质，属于抗微生物肽的一类。存在于脊椎动物、无脊椎动物和植物等生物类群中。

防御素有很强的抗细菌、真菌和具囊膜病毒的作用。虽然目前对防御素的抑菌机理尚无明确的定论，流行的观点是带正电的防御素与带负电的细菌细胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的离子通道，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量下降，最终使靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。正是由于这种特殊的作用机理，使防御素具备两个特点：一是抗性谱广，二是目的微生物难以对防御素产生抗性突变。这就是科学家们对其应用前景看好的重要依据。

银杏(Ginkgo biloba)，又名白果、公孙树，是现存裸子植物中最古老的遗植物之一，人称“活化石”。银杏从栽种到结果要二十多年，四十年后才能大量结果，能活到一千多岁，是树中的老寿星。银杏种子营养丰富，具有天然保健作用，长期食用能够延缓衰老，益寿延年，在宋代被列为皇家贡品。

自然界中银杏树几乎不会感染疾病，研究者们围绕这种特殊的植物进行了大量的研究。例如，Huang等(2000)已经从银杏叶子中分离纯化得到一种几丁质结合蛋白，Shen等(2005)从银杏中克隆到一种茉莉酮酸酯依赖的防御素基因。Wang等(2000)从银杏果仁中分离出一种具有抑制HIV-1反转录酶活性的新抗菌蛋白。

发明人通过构建CDNA文库，获得了一个新的银杏防御素基因序列，将本发明的防御素及其编码基因在数据库中搜索，没有发现任何相同序列。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种银杏防御素。

本发明的第二个目的在于提供本发明银杏防御素的编码基因。

本发明的第三个目的在于将本发明的银杏防御素应用于制备抗病菌类产品。

本发明所选择的银杏(Ginkgo biloba)采自中国江苏新沂。

本发明用构建cDNA文库的方法，从中国江苏新沂银杏果仁克隆得到防御素家族成员。

银杏果仁cDNA文库的构建：首先分离银杏果仁，提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平板上挑取单克隆保种。

本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，得到6条EST序列编码银杏防御素家族成员，申请人将之命名为银杏防御素GD01，银杏防御素成熟肽由48个氨基酸组成，等电点为9.05，分子量为5.43千道尔顿，银杏防御素具有典型的防御素一级结构的特征，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，具体如下：

Arg Thr Cys Lys Ser Gln Ser His Lys Phe Lys Gly Tyr Cys Leu Ser Asp Thr

1                                   10

Asn Cys Arg Asn Val Cys Arg Thr Glu Gly Phe Gly Thr Gly Ser Cys Asp Phe

    20                                      30

Ala Ser Arg Lys Cys Tyr Cys Tyr Lys Pro Cys Val

            40

该成熟肽可以通过分离纯化得到，HPLC鉴定其纯度达到96.5％，MALDI-TOF鉴定其分子量正确。

本发明的银杏防御素，为如下(a)或(b)所述的多肽：

(a)具有序列表中SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，即银杏防御素GD01；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过个别氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。